Summary

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

Published: January 23, 2019
doi:

Summary

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

Abstract

후 성적인 규정 유전자 발현에 있는 중앙 역할을 재생합니다. 히스톤 수정 1960 년대에서 발견 되었다, 이후 그 생리 및 병 적인 기능 광범위 하 게 공부 되었다. 실제로, 다음-세대 깊은 시퀀싱 및 특정 히스톤 수정 항 체를 통해 chromatin immunoprecipitation (칩)의 출현 게놈에 걸쳐 후 성적인 규칙의 우리의 보기를 혁명 하고있다. 반대로, 조직 일반적으로 다양 한 종류의 세포를 구성 하 고 그들의 복잡 한 혼합물 특정 세포 유형에 epigenome 조사 분석 도전 포즈. 게놈 넓은 방식 셀 유형 특정 chromatin 상태를 해결 하기 위해 우리는 최근 협동 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq), chromatin의 선택적 정화 셀에서 태그 코어 히스톤 단백질에 의해 기반으로 개발 뒤에 칩이 관심의 종류 이 프로토콜의 목표는 tChIP이 모범 사례 소개 이 기술은 다양 한 히스톤 수정 및 모형 유기 체에서 조직 관련 epigenome 조사에 대 한 다양 한 도구를 제공합니다.

Introduction

다양 한 세포 유형 동물의 조직에 의하여 이루어져 있다. 유전자 규칙 각 셀에 셀 형식을 정의합니다. Chromatin 수정 DNA 메 틸 화와 히스톤 수정-셀 형 특이성 유전자 발현의 기반이 됩니다. 따라서, 각 세포 유형에 있는 후 성적인 규정의 측정, 원하는 하지만 그것은 기술적인 도전 하고있다.

특정 셀 형식에 epigenetics 조사, 탠덤 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 최근 개발 된 (그림 1)1했다. TChIP에 피토 프 태그 코어 히스톤 단백질 H2B 셀 형식 관련 발기인에서 표현 된다. 소재는 다양 한 종류의 세포 혼합물에서 시작 하지만이 기능은 관심의 세포에서 chromatins의 절연이 있습니다. 다음 칩 Seq-히스톤 수정 마크와의 다음-세대 깊은 시퀀싱을 통해 chromatin 정화 절연 DNA-우리 게놈 넓은 방식 대상된 세포 유형의 후 성적인 상태를 모니터링할 수 있습니다.

이 기술을 사용 하 여, 우리 신경 관련 trimethylation 히스톤 H3 리 4 (H3K4me3)에서 단백질의 최근 조사 표. 그 연구에 우리 개발 노크에 마우스는 C-말기 플래그 태그 H2B에 단백질 Cre 중재 재결합 (Rosa26CAG floxed pA H2B-플래그)에 따라 표현 했다. CamK2a 발기인의 통제 Cre endoplasmic 그물 (응급실) 유전자를 보유 하는 마우스와 함께 횡단에 의해 얻은 마우스 선 tamoxifen 주입 (Camk2aH2B 플래그)1시 활성 뉴런에서 H2B 플래그를 유도 한다. 설립된 마우스 라인의 두뇌에서 시작, 우리는 안티-H3K4me3 항 체와 tChIP-Seq 수행. H3K4me3 마크는 종종 발기인 지구에 해당, 이후 우리 신경1에서 구체적으로 표현 하는 mRNAs의 수백을 발견 수 있습니다.

여기, 우리는 도서관 건설 (그림 1)를 조직 해 부에서 단계를 커버 하는 전형적인 tChIP-Seq 메서드를 설명 합니다. 이 프로토콜의 최종 목표는 tChIP-Seq의 성능 및 다른 세포 유형 및 히스톤 수정이이 방법의 미래 응용 프로그램에 대 한 우리의 모범 사례를 공유 하는 것입니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드를 RIKEN (H27-EP071)의 안전 부문에 의해 승인 하 고 관련 지침 및 규정 실시 되었습니다. 1. 조직 해 부 작은 조각으로 관심의 조직 부 (약 < 3 m m2) 좋은 봄이 위를 사용 하 여.참고: 큰 조직 파편, 동결 하는 데 걸리는 그리고 작은 조각 버퍼, 결과 영향을 미칠 수 있습니다 둘 다의 더 큰 볼륨에 수행 한다. 액체 질소로 채워진 깨?…

Representative Results

여기, 우리 조직 절 개, 고정, 세포 세포의 용 해, 탠덤 정화 chromatin, 및 DNA 도서관 준비 다음-세대 시퀀서에 대 한 설명. 절차, 중 하나는 여러 단계 (그림 2)에서 성공적인 시퀀싱 열쇠 DNA의 품질을 테스트할 수 있습니다. 때문에 단일 nucleosome 147 bp DNA 4로 일반적으로 둘러싸여, 전단된 DNA 크기 보다 짧은 수 없습니다. Ultrasonication, 직후…

Discussion

우리의 프로토콜 플래그 태그 H2B 표현의 tamoxifen 주입에 의해 유도 된다 마우스 뇌의 뉴런에 대 한 최적화 되었다. 발기인 H2B 식, 시작 조직 자료의 양과 조직에 사용 되는 성공적인 tChIP-이 대 한 중추적인 매개 변수 따라서, 이러한 요소의 최적화 관심의 각 세포 유형에 대 한 고려 되어야 한다.

이 프로토콜에 사용 되는 절차 중 중요 한 단계는 100-500 bp5는 chrom…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 원고의 중요 한 독서의 이와사키 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 이 작품은 의해 부분적으로 지원 한 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (S.N. 고 S.I. 하 JP17H05679 #26113005); 젊은 과학자 들에 대 한 특정 (A) (JP17H04998 S.I. 하) 교육, 과학, 스포츠, 및 일본 (MEXT);의 문화에서 그리고는 개척 프로젝트 “세포 진화”와 모든 RIKEN 프로젝트 “질병 및 Epigenome” RIKEN에서 (S.N. S.I. 하)입니다.

Materials

Protein LoBind tube, 2 mL Eppendorf No. 0030108132 For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf No. 0030108116 For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf No. 0030108051 For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube BIO-BIK 3247-00 For ChIP and library preparation
SK Mill TOKKEN SK-200 Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet TOKKEN SK-100-DLC10 Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube TOKKEN TK-AM5-SUS An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder TOKKEN SK-100-TL An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free Pierce 28906 To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine Nacalai Tesque 17109-35 Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x) Nacalai Tesque 14249-24 For washing lysate and purified DNA
HEPES Nacalai Tesque 02443-05 For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade Nacalai Tesque 06900-14 For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 311-90075 For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 072-04945 For lysis buffer 1
NP-40 Nacalai Tesque 25223-75 For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade Nacalai Tesque 12967-32 For Lysis buffer 1
Tris Nacalai Tesque 35406-91 For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral Nacalai Tesque 08947-35 For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x) Nacalai Tesque 25955-24 To block degradation of protein
RIPA buffer Thermo Fisher Scientific 89900 For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber Covaris 520130 Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator Covaris S220 or E220 To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS Thermo Fisher Scientific 15553-027 For ChIP Elution Buffer
RNase A Nacalai Tesque 30141-14 To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115887001 To purify DNA from lysate
Ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 054-07225 Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Thermo Fisher Scientific 11201D This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 301-34811 Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent Sigma-Aldrich 11096176001 For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution Nacalai Tesque 10727-74 For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml) Thermo Fisher Scientific AM9510 To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866 For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube Axygen 10011-830 For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nacalai Tesque 25970-56 To purify DNA from lysate
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack Funakoshi IR-1 To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler New England Biolabs T7771S Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software Agilent Technologies G2946CA Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit Roche 07961898001 Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes BIOO Scientific NOVA-514101 Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit Roche 07959028001 Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix Roche KM2602 For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB Qiagen 19086 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate Thermo Fisher Scientific 4309849 For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4485701 To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311 For plate sealing
End-repair master mix Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer Broad Institute IGV_2.3.88 Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ Eurofins Genomics A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ Eurofins Genomics A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq Takara RR420L To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice Takara TP870 To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region

References

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Cite This Article
Mito, M., Kadota, M., Nakagawa, S., Iwasaki, S. TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling. J. Vis. Exp. (143), e58298, doi:10.3791/58298 (2019).

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