JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Isolering af primære mus hepatocytter for spirende Protein syntese analyse af ikke-radioaktive L-azidohomoalanine mærkning metode

Published: October 23, 2018
doi:
10.3791/58323
, , , , , ,
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine,University of Cincinnati, 2Division of Endocrinology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 4Department of Pediatrics, College of Medicine,University of Cincinnati

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til isolering af sunde og funktionelle primære mus hepatocytter. Instruktioner til påvisning af hepatisk spirende proteinsyntese af ikke-radioaktive mærkning substrat blev givet til at hjælpe med at forstå de mekanismer, der ligger til grund proteinsyntesen i forbindelse med energi-stofskifte homøostase i leveren.

Abstract

Hepatocytter er parenkymalt celler i leveren og engagere flere metaboliske funktioner, herunder syntese og sekretion af proteiner afgørende for systemisk energi homøostase. Primære hepatocytter isoleret fra murine leveren udgør et værdifuldt biologiske redskab for at forstå de funktionelle egenskaber eller forandringer opstår i leveren. Heri vi beskrive en metode til isolering og kultur af primære mus hepatocytter ved at udføre en to-trins collagenase perfusion teknik og diskutere deres udnyttelse for at undersøge protein metabolisme. Lever af en voksen mus er sekventielt perfunderet med ethylenglycol-bis tetraacetic syre (EGTA) og collagenase, efterfulgt af isolering af hepatocytter med tæthed gradient buffer. Disse isolerede hepatocytter er levedygtige på kultur plader og vedligeholder størstedelen af begavet Karakteristik af hepatocytter. Disse hepatocytter kan bruges til vurdering af protein metabolisme herunder spirende proteinsyntese med ikke-radioaktive reagenser. Vi viser, at de isolerede hepatocytter styres let og omfatte en højere kvalitet og volumen stabilitet af proteinsyntesen knyttet til energimetabolisme ved at udnytte kemo-selektiv ligatur reaktionen med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein metode til påvisning og western blotting analyser. Derfor, denne metode er værdifuld for at undersøge hepatisk spirende proteinsyntesen knyttet til energi homøostase. Følgende protokol skitserer de materialer og metoder til isolering af høj kvalitet primære mus hepatocytter og påvisning af spirende proteinsyntesen.

Introduction

Protein er et vigtigt element, ernæringsmæssige og ca. 50% af tørvægt af en menneskelige krop er sammensat af proteiner, som har flere biologiske egenskaber og funktioner1. Derfor, proteinsyntesen er en af de mest energi forbrugende begivenheder og en ændring i protein metabolisme er stærkt forbundet med udviklingen af sygdomme, herunder metaboliske sygdomme2,3,4. I leveren, proteinsyntese tegner sig for ca. 20-30% af samlede energi forbrug5,6. Derudover proteiner funktion som ikke kun passiv eller byggeklodser af leveren, men også aktive signal-mægle faktorer intracellulært eller extracellularly at regulere den systemiske stofskifte7. For eksempel, reducerede niveauer af serum albumin, der syntetiseres og udskilles af leveren og de mest rigelige proteiner i plasma8, øger risikoen for type 2 diabetes udvikling9,10, 11, hvorimod en højere koncentration af serum albumin er beskyttende mod udvikle stofskiftesyndrom12. Desuden kan forstyrret eller afbrydelse af sekretoriske eller membran-bundet hepatisk proteiner, som modulerer kolesterol homøostase, herunder lipoproteiner, LDLR og LRP1, føre til udviklingen af insulinresistens, hyperlipidæmi eller åreforkalkning 13. derfor identifikation af molekylære patofysiologiske mekanismer, der er involveret i protein metabolisme forstyrrelse i leveren og dens tilknyttede metaboliske komplikationer kan være nyttig for at opdage roman farmakologiske tilgange for at forsinke starten eller behandling af metaboliske sygdomme som insulinresistens, diabetes og ikke-alkoholiske fedtlever.

Proteinsyntese er tæt knyttet til cellulære energi status (f.eks.dannelse af en peptidbinding under trinnet brudforlængelse af proteinsyntesen kræver 4 phosphodiester obligationer14) og er reguleret af molekylære processer, der fornemmer Inter – og intra cellular næringsstoftilgængelighed15,16. AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er en af de intracellulære energi sensorer, at opretholde energi homøostase17. Når AMPK aktiveres når cellulære energi niveauer bliver lavere, funktion AMPK og sin målrettede substrater til at stimulere kataboliske veje og hæmme anabolske processer, herunder protein syntese18,19. Regulering af proteinsyntesen er medieret af fosforylering af flere oversættelse faktorer og ribosomale proteiner20. Af note er pattedyr målet på rapamycin komplekse 1 (mTORC1), en vigtig drivkraft i proteinsyntesen, en af de vigtigste mål i AMPK21. Aktivering af mTORC1 pathway øger cellevækst og spredning af stimulerende proteiner oversættelse og autophagy20,21. Derfor er det logisk, at aktivering af AMPK kan hæmme mTORC1-medieret protein syntese22. Aktivering af AMPK modvirker og direkte phosphorylates mTORC1 på Threonin rester 2446 (Thr2446) fører til dets inaktivering23 og undertrykkelse af protein biosyntesen24. Desuden kan AMPK indirekte hæmme mTORC1 funktionen ved fosforylering og aktivering af knolde sklerose komplekse 2 (TSC2)25 , som er opstrøms af mTORC1 signaling kaskade. Kort sagt, dysregulering af disse veje i leveren er ofte knyttet til udviklingen af metaboliske sygdomme og der er derfor et kritisk behov for at etablere effektive eksperimentelle værktøjer til at undersøge rollen, som disse veje i reguleringen af energi og protein metabolisme i hepatocytter.

Der er en større lighed mellem de funktionelle egenskaber af isolerede primære hepatocytter og i vivo hepatocytter end med in vitro- leveren-afledte celle linjer26,27,28. Det er påvist, at primære humane hepatocytter del 77% lighed med der lever biopsier, hvorimod HepG2 celler, som er godt differentieret hepatisk kræftceller og almindeligt anvendt til at undersøge hepatisk funktioner, vise mindre end 48% i forbindelse med genekspression profiler29. Derfor, udnyttelse af primære hepatocytter, snarere end udødeliggjort kultur celler, er af vital betydning i efterforskningen af leverens funktion og fysiologi, og flere protokoller er tilgængelige for isolation og kultur af primære hepatocytter især fra rotter30,31. Mens rotte hepatocytter er nyttigt med et relativt højere udbytte af celler, har mus hepatocytter et større potentiale i mange videnskabelige aspekter på grund af den store tilgængelighed af genetisk moduleret mus. Der er dog flere tekniske udfordringer i isolere sund og rigelige primære hepatocytter fra mus for Cellulær og molekylær-baserede vurderinger: første kanyle indsættelse til perfuse leveren med buffer reagenser er meget vanskeligt at håndtere på grund af den lille og tynd mus portal vene eller ringere vena cava; for det andet kan længere manipulation af celler under isolation medføre reduktion i celle kvantitet og kvalitet; tredje, ikke-enzymatisk mekanisk separation metoder kan resultere i alvorlige skader og producere et lavt udbytte af levedygtige isolerede primære hepatocytter32,33. I 1980 ‘ erne, blev collagenase perfusion teknik introduceret til isolering af hepatocytter fra lever af dyr34. Denne metode er baseret på collagenase perfusion af lever35,36,37, infusion af leveren med calcium chelator løsning38,39, enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af hepatisk parenkym35. I det første skridt, er en mus lever perfunderet med en calcium [Ca2 +] gratis buffer indeholdende en [Ca2 +] chelator (ethylendiamin tetraacetic acid, EDTA). I andet trin af er musen leveren perfunderet med en collagenase-holdige buffer at hydrolysere cellulære-ekstracellulære matrix interaktioner. I modsætning til den buffer, der bruges i trin et, tilstedeværelsen af [Ca2 +] ioner i buffer på det andet trin er nødvendige for effektiv collagenase aktivitet, hvorefter fordøjet leveren har yderligere forsigtigt og mekanisk adskilles ved hjælp af pincet mellem den hepatisk kapsel og parenkyme væv. Endelig, bindevæv er fjernet ved filtrering, og efterfølgende centrifugering adskiller levedygtige hepatocytter fra både ikke-parenkymalt celler og ikke-levende hepatocyt med brug af tæthed gradient buffer40,41 ,42. I den foreliggende undersøgelse viser vi en modificeret totrins collagenase perfusion teknik til at isolere primære hepatocytter fra en mus lever til analyse af proteinsyntesen.

Radiolabeling af proteiner er meget udbredt at kvantificere niveauerne for udtryk, omsætning satser, og fastlægge biologiske fordelingen af proteiner43 som følge af den høje følsomhed påvisning af radioaktivitet44. Anvendelse af radioaktive isotoper kræver imidlertid meget kontrolleret forskning omstændigheder og procedurer45. Alternative ikke-radioaktive metoder er blevet udviklet og har i stigende grad vundet i popularitet. Kemo-selektiv ligatur reaktion med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein påvisningsmetode er en af dem og er baseret på den kemo-selektiv reaktion mellem et indeholder og alkyn grupper46, som kan udnyttes til at analysere cellulære begivenheder såsom påvisning af spirende proteinsyntesen og underklasser af glykoproteiner modificeret med en indeholder gruppen. For spirende proteinsyntese, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en indeholder-ændret aminosyre) metabolisk indarbejdet i proteiner og påvises ved hjælp af TAMRA protein opdagelse metode47. Ved hjælp af denne analyse i primære mus hepatocytter, vi viser, den spirende proteinsyntese sats er tæt knyttet til tilgængeligheden af ATP fra mitokondrie og AMPK aktivering (figur 1).

I Resumé, udnyttelse af primære mus hepatocytter er afgørende at undersøge protein og energi metabolisme og kvantificere spirende proteinsyntesen er værdifulde for at få indsigt i den fysiologiske rolle af veje, der er relevante for udviklingen og helbredelse af hepatocyt-relaterede sygdomme.

Protocol

Denne protokol indeholder brugen af laboratoriemus. Dyrs pleje og eksperimentelle procedurer blev udført efter procedurer, der er godkendt af dyrs pleje udvalg af Cincinnati børn Hospital Medical Center. 1. isolering af primære mus hepatocytter Før isolation præparater Forberede 450 mL 40% tæthed gradient buffer, som beskrevet i tabel 1 og holde ved 4 ° C (15 mL/mus). Forberede 500 mL af Williams’ Medium som beskrevet i tabel 1</stro…

Representative Results

Primære mus hepatocytter isolation medfører et udbytte på ca 20 x 106 samlede celler/mus. Histologisk, levende og vedlagte primære hepatocytter vises polygonale eller typiske sekskantede form med klart skitseret hindeagtige grænse efter 24 timers inkubation (figur 2). For at bekræfte, om isolerede celler primære hepatocytter, forhold vi udtryk niveauer af albumin protein i isolered…

Discussion

Selv om flere udødeliggjort hepatisk cellelinjer har været foreslået og brugt til at undersøge leveren fungerer49,50,51,52, mangler disse celler generelt den vigtige og grundlæggende funktioner af normale hepatocytter, som udtryk for albumin (figur 3). Det er derfor almindeligt anerkendt, at udnytte primære hepatocytter er en værdifuld mulighed for at behand…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Drs. Joonbae Seo og Vivian Hwa for deres videnskabelige input og drøftelser. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. blev støttet af PRESTO fra Japan videnskab og teknologi agentur. En del af denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra NIH (P30DK078392) for mave sygdom forskning Core Center i Cincinnati.

Materials

HEPES buffer Fisher Scientific BP310-500
D-glucose Fisher Scientific D16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid AmericanBio AB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240-062
HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red Gibco 14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) Fisher Scientific C79-500
Density gradient buffer GE Healthcare 17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate Gibco 11885-084
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) Gibco 1897141
Williams medium E, no glutamine Gibco 12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement Gibco 35050-061
Collagenase Type X Wako Pure Chemical Industries 039-17864
Perfusion pump Cole-Parmer Masterflex L/S Equipment
IV administration set EXELINT 29081 Equipment
A water bath REVSCI RS-PB-200 Equipment
Tube heater Fisher Scientific Isotemp Equipment
Ethanol Decon Lab, Inc 0-39613
Isoflurane PHOENIX 10250
Autoclaved Cotton Tips Fisherbrand 23-400-124
100 mm Petri Dish TPP 93100
Connector (Male Luer Lock Ring) Cole-Parmer instrument EW-4551807
24G catheters TERUMO Surflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS) VWR 10199-658
15 ml conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-666
50 ml conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE Invitrogen C33370
AHA (L-azidohomoalanine) Invitrogen C10102
DMEM (methionine free) Gibco 21013024
L-Cystine Dihydrochloride SIGMA C2526
Laemmli sample buffer BioRad 161-0737
Protease Inhibitor Cocktail SIGMA P9599
SDS solution (20%) BioRad 161-0418
Tris-HCL (1M) American Bioanalytical AB14044-01000
Phosphatase Inhibitor Cocktail SIGMA P5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) BioRad 500-0207
6-well tissue culture plate TPP 92006
Digital Heatblock VWR 12621-092 Equipment
Multi-Rotator Grant-bio PTR-60 Equipment
Ultrasonic Sonicator Cole-Parmer GE130PB Equipment
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer VWR 97043-566 Equipment
A variable mode laser scanner GE Healthcare Life Science FLA 9500 Equipment
Coomassie-dye reagent Thermo Scientific 24594
Inverted microscope Olympus CKX53 Equipment
Western Blotting apparatus BioRad 1658004 Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R Equipment
Automated cell counter BioRad TC20 Equipment
FluorChem R system proteinsimple – Equipment
p-Ampka (T172) antibody Cell signaling 2535
Total-AMPK antibody Cell signaling 5832
Albumin antibody Cell signaling 4929
beta actin antibody Santa Cruz sc-130656
Fine scissors and forceps
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
  2. Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
  3. De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
  4. Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
  5. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
  6. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
  7. Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
  8. Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
  9. Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
  10. Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
  11. Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
  12. Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
  13. Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
  14. Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
  15. Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
  16. Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
  17. Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade–a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
  18. Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
  19. Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
  20. Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
  21. Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
  22. Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
  23. Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
  24. Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
  25. Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
  26. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
  27. Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
  28. Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
  29. Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
  30. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  31. Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer’s cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
  32. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
  33. Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
  34. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
  35. Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
  36. Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
  37. Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
  38. Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
  39. Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
  40. Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes–past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
  41. Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
  42. Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  43. Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
  44. Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
  45. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
  46. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
  47. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
  48. Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
  49. Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
  50. DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
  51. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
  52. Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
  53. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).

Tags

Primary Mouse HepatocytesNascent Protein SynthesisL-azidohomoalanine LabelingNon-radioactiveLiver PerfusionCollagenaseDensity Gradient SeparationMetabolic Disease ResearchObesityNon-alcoholic Fatty LiverType Two Diabetes
check_url/58323?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Salem, E. S., Murakami, K., Takahashi, T., Bernhard, E., Borra, V., Bethi, M., Nakamura, T. Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method. J. Vis. Exp. (140), e58323, doi:10.3791/58323 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image