בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine
Summary
כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.
Abstract
Hepatocytes הם תאים parenchymal של הכבד וקיום מספר פונקציות מטבוליות, כולל סינתזה הפרשת חלבונים חיוניים עבור אנרגיה מערכתית הומאוסטזיס. ראשי hepatocytes בודד מהכבד מאתר מהווים כלי ביולוגי חשוב להבין את מאפייני תפקודית או שינויים המתרחשים בכבד. בזאת אנחנו מתארים שיטה הבידוד והתרבות של העכבר הראשי hepatocytes על-ידי ביצוע טכניקה זלוף collagenase שני שלבים ולדון שלהם ניצול של חוקר חלבונים. הכבד של העכבר למבוגרים ברצף perfused עם אתילן גליקול-bis tetraacetic חומצה (EGTA) ו- collagenase, ואחריו את ניתוקה של hepatocytes עם המאגר הדרגתיות צפיפות. אלה hepatocytes מבודד קיימא על תרבות צלחות, לשמור על הרוב המכריע של מאפייני hepatocytes מצויד. אלה hepatocytes יכול לשמש עבור הערכות של חלבון מטבוליזם כולל סינתזה של חלבון המתהווה עם ריאגנטים שאינו רדיואקטיבי. אנחנו מראים כי hepatocytes מבודד נשלטים בקלות, מהווים יציבות איכות ונפח גבוה יותר של סינתזת חלבונים קשורה לחילוף חומרים של אנרגיה על-ידי ניצול התגובה מצדו הכימותרפיה סלקטיבית עם חלבון Tetramethylrhodamine (טמרה) שיטת זיהוי וניתוחים המערבי סופג. לכן, בשיטה זו הוא יקר עבור חוקר סינתזה של חלבון nascent הכבד קשור אנרגיה הומאוסטזיס. להלן כללי התנהגות מתווה של חומרים ושיטות על בידודו של העכבר הראשי באיכות גבוהה hepatocytes וזיהוי של סינתזת חלבונים המתהווה.
Introduction
חלבון הוא מרכיב תזונתי חשוב, כ-50% מהמשקל היבש של גוף האדם מורכב של חלבונים אשר יש מספר תכונות ביולוגיות, פונקציות1. כתוצאה מכך, סינתזת החלבון הוא אחד האירועים רב רוב האנרגיה, שינוי חלבון מטבוליזם קשורה מאוד להתפתחות של מחלות, כולל מחלות מטבוליות-2,–3,–4. בכבד, חלבון ביוסינטזה חשבונות עבור 20-30% מכלל האנרגיה הכוללת צריכת5,6. בנוסף, הפונקציה חלבונים לא רק פסיבי או בניית בלוקים של הכבד, אבל גורמים מתווכים-אות פעיל גם intracellularly או extracellularly כדי לווסת את חילוף החומרים מערכתית7. למשל, הפחתת רמות של אלבומין, אשר מסונתז והוא מופרש על ידי הכבד ואת החלבון הנפוץ ביותר של פלזמה8, מגביר את הסיכון של סוג 2 סוכרת פיתוח9,10, 11, ואילו ריכוז גבוה יותר של אלבומין הוא מגן מפני לפתח תסמונת מטבולית12. יתר על כן, להפריע או שיבוש חלבונים הכבד הפרשה או מאוגד-ממברנה, אשר לווסת את הכולסטרול הומאוסטזיס, לרבות lipoproteins, LDLR LRP1, יכול להוביל להתפתחות של תנגודת לאינסולין, היפרליפידמיה או טרשת עורקים 13. לכן, הזיהוי של המנגנונים המולקולריים הקשורים pathophysiological המעורבים חלבון הפרעה מטבוליזם בכבד, סיבוכים מטבוליים המשויכת שלו עשוי להיות שימושי עבור גילוי הרומן תרופתי גישות מפגר תחילת או לטפל במחלות מטבוליות כגון עמידות לאינסולין, סוכרת, כבד שומני אלכוהוליים.
סינתזה של חלבון מקושר באופן הדוק למצב האנרגיה התאית (למשל, היווצרות של קשר פפטידי אחד במהלך השלב התארכות של סינתזת חלבונים דורש phosphodiester 4 אג ח14) הוא מוסדר על ידי מסלולים מולקולריים המרגישות אינטר – ו intra – cellular זמינות חומרי הזנה15,16. מופעל כח פרוטאין קינאז (AMPK) הוא אחד חיישנים תאיים אנרגיה לשמור על הומאוסטזיס אנרגיה17. ברגע AMPK מופעל כאשר רמות האנרגיה התאית הופכים התחתון, AMPK ותערובות יישוב שלה לפעול כדי לעורר מסלולים קטבולי ומעכבות התהליכים האנאבוליים כולל חלבון סינתזה18,19. התקנון של סינתזת חלבונים מתווך על ידי זירחון של מספר חלבונים ribosomal20וגורמי תרגום. ראוי לציין, בתרבית של היעד של rapamycin 1 מורכבים (mTORC1), מנהל התקן הגדולות של סינתזת חלבונים, היא אחת המטרות המרכזיות של AMPK21. הפעלה של הנתיב mTORC1 משפר את צמיחת תאים והתפשטות על ידי גירוי חלבון autophagy ותרגום20,21. לכן זה הגיוני כי הפעלה של AMPK יכול לעכב סינתזת חלבון בתיווך mTORC122. אכן, הפעלה של AMPK מנטרל, ישירות phosphorylates mTORC1 על שאריות תראונין 2446 (חמישי2446) המוביל שלה איון23 דיכוי חלבון ביוסינטזה24. יתר על כן, AMPK בעקיפין יכול לעכב mTORC1 פונקציה על ידי זרחון והפעלה של tuberous טרשת נפוצה מורכבים 2 (TSC2)25 המהווה הרגולטור במעלה הזרם של המפל איתות mTORC1. בקיצור, dysregulation של המסלולים הללו בכבד קשורה פעמים רבות התפתחות מחלות מטבוליות, ולכן אין צורך חיוני בהקמת יעיל ניסוי כלים לחקור את התפקיד של המסלולים הללו בוויסות של אנרגיה, חלבון מטבוליזם ב hepatocytes.
יש דמיון חזק בין מאפייני hepatocytes העיקרי מבודד פונקציונלי ויוו hepatocytes מאשר עם במבחנה הכבד-derived תא קווים26,27,28. הוכח כי ראשי hepatocytes האנושי לשתף 77% דמיון עם זה של ביופסיות כבד, בעוד HepG2 תאים, אשר הינם תאים סרטניים הכבד היטב הבדיל בשימוש נרחב כדי לחקור פונקציות הכבד, להציג פחות מ- 48% בהקשר של ביטוי גנים פרופילי29. לכן, ניצול hepatocytes הראשית, יותר מאשר מונצחים התרבות תאים, הוא בעל חשיבות בחקירת תפקוד הכבד, פיזיולוגיה, מספר פרוטוקולים זמינים עבור הבידוד והתרבות של ראשי hepatocytes במיוחד של חולדות30,31. אמנם hepatocytes עכברוש שימושיים עם תשואה גבוהה יחסית של תאים, hepatocytes העכבר יש פוטנציאל גדול בהיבטים מדעיים רבים בגלל הזמינות רחב של עכברים גנטית מאופנן. עם זאת, ישנם מספר אתגרים טכניים לבודד בריא ושופע hepatocytes העיקרי של עכברים עבור הערכות סלולאריים מולקולריים מבוססות: ראשית, בצינורית ההכנסה כדי perfuse את הכבד עם ריאגנטים מאגר קשה מאוד להתמודד עם בשל וריד שער קטן ורזה העכבר או הכלילי; שנית, זמן רב יותר מניפולציה של תאים בתקופת הבידוד יכול לגרום להפחתת תא בכמות ובאיכות; שיטות הפרדה מכניות השלישי, שאינם אנזימטי יכול לגרום נזק חמור ומפיקים תשואה נמוכה של קיימא hepatocytes העיקרי מבודד32,33. בשנות ה-80, טכניקה זלוף collagenase הוצג לבידוד hepatocytes מ הכבדים של חיות34. שיטה זו מבוססת על collagenase זלוף של הכבד35,36,37, אינפוזיה של הכבד עם סידן chelator פתרון38,39, עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכני של הכבד parenchyma35. בשלב הראשון, כבד עכבר הוא perfused עם סידן [Ca2 +] מאגר חינם המכילה [Ca2 +] chelator (חומצה tetraacetic ethylenediamine, EDTA). בשלב השני, הכבד העכבר הוא perfused עם מאגר המכיל collagenase כדי hydrolyze את האינטראקציות מטריצה חוץ-תאית הסלולר. בניגוד המאגר המשמש בשלב אחד, הנוכחות של יונים [Ca2 +] במאגר של השלב השני נדרשת לפעילות יעילה collagenase, לאחר מכן את הכבד מתעכל יש נוספת מכנית ובעדינות יופרדו באמצעות מלקחיים בין כמוסת הכבד ורקמות parenchymatous. לבסוף, רקמת חיבור מוסר על-ידי סינון, ומפריד צנטריפוגה עוקבות hepatocytes קיימא מתאי parenchymal הן, שאינם חיים hepatocyte עם השימוש של צפיפות מאגר הדרגתיות40,41 ,42. במחקר הנוכחי, אנו מראים טכניקה זלוף collagenase שני שלבים ששונה כדי לבודד hepatocytes העיקרי של כבד עכבר לניתוח של סינתזת החלבון.
Radiolabeling של חלבונים נעשה שימוש נרחב כדי לכמת את רמות הביטוי, שיעורי מחזור, לקבוע את התפלגות הביולוגי של חלבונים43 עקב הרגישות הגבוהה של גילוי הרדיואקטיביות44. עם זאת, השימוש של איזוטופים רדיואקטיביים דורש מחקר מבוקרת מאוד הנסיבות והנהלים45. שיטות אלטרנטיביות שאינו רדיואקטיבי פותחו, יש יותר ויותר זכו לפופולריות רבה. התגובה מצדו הכימותרפיה סלקטיבית עם שיטת זיהוי החלבון Tetramethylrhodamine (טמרה) הוא אחד מהם, והוא מבוסס על התגובה הכימותרפיה סלקטיבית בין אלקין ו קבוצות46, אשר יכול להיות מנוצל כדי לנתח הסלולר אירועים כגון זיהוי סינתזה של חלבון המתהווה, מחלקות של glycoproteins ששינה עם קבוצה אזיד. סינתזה של חלבון המתהווה, L-Azidohomoalanine (L-AHA, חומצת אמינו אזיד-השתנה) יכול להיות סמויה משולבים לחלבונים, שאותרו על-ידי שימוש בשיטת47זיהוי חלבונים טמרה. על-ידי שימוש assay הזה hepatocytes העכבר הראשי, אנו מראים כי קצב סינתזת חלבון nascent בחוזקה קשורה בזמינות של ATP מ מיטוכונדריאלי AMPK ההפעלה (איור 1).
לסיכום, ניצול של העכבר הראשי hepatocytes חיוני כדי לחקור את חילוף החומרים חלבון ואנרגיה, לכימות סינתזה של חלבון nascent יקר, להשגת תובנות תפקיד פיזיולוגי המסלולים הרלוונטיים לפיתוח ו לרפא מחלות הקשורות hepatocyte.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות מספר שורות תאי הכבד מונצחים יש כבר הציע והשתמשת לחקור פונקציות הכבד49,50,51,52, תאים אלה חסרים בדרך כלל חשוב ובסיסי פונקציות של hepatocytes רגיל, כגון הביטוי של אלבומין (איור 3). זה מוכר ברבים, לכן, כי ניצול hepat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד”ר Joonbae Seo ו ויויאן Hwa עבור קלט מדעי ודיון שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) (R01DK107530). T.N. נתמכה על ידי אוטם יפן המדע, הטכנולוגיה הסוכנות. חלק של מחקר זה נתמך על ידי מענק של NIH (P30DK078392) עבור מרכז הליבה המחקר של מחלות העיכול בסינסינטי.
Materials
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade–a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer’s cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes–past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
