Her presenterer vi en protokoll for isolasjon hepatocytes sunn og funksjonelle hovedknappen på musen. Instruksjoner for å oppdage hepatic begynnende proteinsyntese av ikke-radioaktivt merking underlaget ble gitt til å forstå mekanismene bak proteinsyntese i sammenheng med energi-metabolisme homeostase i leveren.
Hepatocytter er parenchymal celler i leveren og engasjere flere metabolske funksjoner, inkludert syntese og sekresjon av proteiner viktig for systemisk energi homeostase. Primære hepatocytter isolert fra murine leveren utgjør et verdifullt biologiske verktøy for å forstå funksjonelle egenskaper eller endringer forekommer i leveren. Her vi beskriver en metode for isolasjon og kultur hepatocytes hovedknappen på musen ved å utføre en totrinns collagenase perfusjon teknikk og diskutere utnyttelse for å undersøke protein metabolisme. Leveren av en voksen mus er sekvensielt parfyme med etylenglykol-bis tetraacetic syre (EGTA) og collagenase, etterfulgt av isolering av hepatocytter med tetthet gradert bufferen. Disse isolerte hepatocytter er levedyktig på kultur plater og opprettholde fleste utstyrt egenskaper hepatocytes. Disse hepatocytter kan brukes for vurderinger av protein metabolisme inkludert begynnende proteinsyntese med ikke-radioaktivt reagenser. Vi viser at de isolerte hepatocytter er lett kontrollert og utgjør en høyere kvalitet og volum stabilitet i proteinsyntese knyttet til energi metabolism ved å benytte chemo-selektiv ligation reaksjon med et Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein oppdagelse metode og vestlige blotting analyser. Denne metoden er derfor verdifulle for å undersøke hepatic begynnende proteinsyntese knyttet til energi homeostase. Følgende protokollen skisserer materialer og metoder for isolering av høy kvalitet hovedknappen på musen hepatocytter og påvisning av begynnende proteinsyntese.
Protein er viktig ernæringsmessige og ca 50% av tørrvekt av en menneskekropp består av proteiner som har flere biologiske egenskaper og funksjoner1. Derfor proteinsyntese er en av de mest energi forbruker hendelsene og endring i protein metabolismen er svært knyttet til utviklingen av sykdommer, inkludert metabolske sykdommer2,3,4. I leveren, protein biosyntesen utgjør ca 20-30% av totale energi forbruk5,6. I tillegg proteiner funksjonen som ikke bare passiv eller byggesteinene i leveren, men også aktiv signal-formidling faktorer intracellulært eller extracellularly å regulere systemisk metabolisme7. For eksempel, reduserte nivåer av serum albumin, som syntetiseres og skilles ut av leveren og mest rikelig protein i plasma8, øker risikoen for type 2 diabetes utvikling9,10, 11, hvor en høyere konsentrasjon av serum albumin er beskyttende mot utvikler Metabolsk syndrom12. Videre kan forstyrret eller forstyrrelse av sekretoriske eller membran-bundet hepatic proteiner, som modulerer kolesterol homeostase, inkludert lipoproteiner, LDLR og LRP1, føre til utviklingen av insulinresistens, hyperlipidemi eller åreforkalkning 13. derfor identifikasjon av molekylære patofysiologiske mekanismer som er involvert i protein metabolisme forstyrrelser i leveren og dens tilknyttede metabolske komplikasjoner kan være nyttig for å oppdage romanen farmakologiske tilnærminger for å retard utbruddet eller behandle metabolske sykdommer som diabetes og insulinresistens, og alkoholfrie fettlever.
Proteinsyntese er tett knyttet til statusen celleenergien (f.eksdannelsen av en peptid obligasjon under forlengelse trinn i proteinsyntese krever 4 phosphodiester obligasjoner14) og er regulert av molekylære trasé som forstand Inter – og intra – cellular næringsstoffer tilgjengelighet15,16. AMP-aktivert protein kinase (AMPK) er en av intracellulær energi sensorer som vedlikeholder energi homeostase17. Når AMPK er aktivert når cellular energi nivåer blir lavere, fungerer AMPK og sin målrettede underlag for å stimulere katabolske veier og hemme anabole prosesser inkludert protein syntese18,19. Regulering av proteinsyntese er formidlet av fosforylering flere oversettelse faktorer og ribosomal proteiner20. Legg merke er til pattedyr målet på rapamycin komplekse 1 (mTORC1), en viktig drivkraft i proteinsyntese, en av de viktigste målene for AMPK21. Aktivering av den mTORC1 veien forbedrer cellevekst og spredning av stimulerende protein oversettelsen og autophagy20,21. Derfor er det logisk at aktivering av AMPK kan hemme mTORC1-mediert protein syntese22. Faktisk aktivering av AMPK motvirker og direkte phosphorylates mTORC1 på threonin rester 2446 (Thr2446) fører til inaktivering23 og undertrykkelse av protein biosyntesen24. Videre kan AMPK indirekte hemme mTORC1 funksjonen ved fosforylering og aktivering av tuberous sklerose komplekse 2 (TSC2)25 som er oppstrøms regulator av mTORC1 signalnettverk cascade. Kort sagt, feilregulering av disse i leveren er ofte knyttet til utvikling av metabolske sykdommer, og derfor er det et kritisk behov for å etablere effektive eksperimentelle verktøy for å undersøke rollen av disse i regulering av energi og protein metabolisme i hepatocytter.
Det er en sterkere likhet mellom isolerte primære hepatocytter funksjonelle egenskaper og i vivo hepatocytter enn med i vitro lever-avledet cellen linjer26,27,28. Det har vist at primære menneskelige hepatocytter deler 77% likhet med at av leveren biopsier, mens HepG2 celler, som er godt differensiert hepatic kreftceller og brukte å undersøke hepatic funksjoner, vise mindre enn 48% i sammenheng med genuttrykk profiler29. Derfor utnyttelse av primære hepatocytter, i stedet for udødeliggjort kultur celler, er av avgjørende betydning i å undersøke nedsatt funksjon og fysiologi, og flere protokoller er tilgjengelig for isolasjon og kultur primære hepatocytes spesielt fra rotter30,31. Mens rotte hepatocytter er nyttig med en relativt høyere avkastning av celler, har musen hepatocytter større potensial i mange vitenskapelige aspekter på grunn av den bredt tilgjengeligheten av genetisk modulert mus. Det er imidlertid flere tekniske utfordringer i isolere sunn og rikelig primære hepatocytter fra mus for mobilnettet og molekylære-baserte vurderinger: først kanyle innsetting å perfuse leveren med buffer reagenser er svært vanskelig å håndtere på grunn av små og tynne mus portalen blodåre eller mindreverdig vena cava; andre kan gangen for lengre manipulasjon av celler under isolasjon forårsake reduksjon i cellen kvantitet og kvalitet; tredje, ikke-enzymatisk mekanisk separasjon metoder kan føre til alvorlige skader og produsere en lav avkastning levedyktig isolert primære hepatocytter32,33. I 1980, ble collagenase perfusjon teknikken introdusert for å isolere hepatocytter fra lever av dyr34. Denne metoden er basert på collagenase perfusjon av leveren35,36,37, tilførsel av leveren med kalsium chelator løsning38,39, enzymatisk fordøyelsen og mekanisk dissosiasjon hepatic parenchyma35. I det første trinnet, er en mus lever parfyme med en kalsium [Ca2 +] gratis buffer inneholder en [Ca2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA). I det andre trinnet er musen leveren parfyme med en collagenase inneholder buffer hydrolyze mobil-ekstracellulær matrix interaksjoner. I motsetning til bufferen i trinn én, tilstedeværelsen av [Ca2 +] ioner i bufferen i det andre trinnet er nødvendig for effektiv collagenase aktivitet, hvoretter fordøyd leveren har mer forsiktig og mekanisk skilles ved hjelp av pinsett mellom de hepatic capsule og parenchymatous vev. Til slutt, bindevev fjernes ved filtrering, og påfølgende sentrifugering skiller levedyktig hepatocytter fra både ikke-parenchymal celler og ikke-levende hepatocyte med bruk av tetthet gradert buffer40,41 ,42. Studien viser vi en endret i two-step collagenase perfusjon teknikk å isolere primære hepatocytter fra en mus lever for analyse av proteinsyntese.
Radiolabeling av proteiner er mye brukt å kvantifisere uttrykk nivåene, Omsetningshastigheten, og biologiske fordelingen av proteiner43 på grunn av høy følsomheten av deteksjon av radioaktivitet44. Imidlertid krever bruk av isotopene kontrollerte forskning omstendigheter og prosedyrer45. Alternative ikke radioaktiv metoder har blitt utviklet og fått stadig i popularitet. Chemo-selektiv ligation reaksjon med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein gjenkjennings-metoden er en av dem og er basert på chemo-selektiv reaksjonen mellom en azide og alkyne grupper46, som kan benyttes til å analysere mobilnettet hendelser som registrere begynnende proteinsyntese og underklasser av glykoproteiner endret med en azide gruppe. For begynnende proteinsyntese, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en azide-modifisert aminosyre) metabolically innlemmet i proteiner og oppdaget ved hjelp av TAMRA proteinet oppdagelsen metoden47. Ved hjelp av denne analysen i hovedknappen på musen hepatocytter, viser vi at den gryende protein syntese rate er tett knyttet til tilgjengeligheten av ATP fra Mitokondrielt og AMPK Aktivisering (figur 1).
Oppsummert utnyttelse hepatocytes hovedknappen på musen er avgjørende for å undersøke den protein og energi metabolismen og kvantifisere begynnende proteinsyntese er verdifull for å få innsikt i fysiologiske rollen av relevant til utviklingen og kur av hepatocyte-relaterte sykdommer.
Selv om flere udødeliggjort hepatic cellelinjer har vært foreslått og brukes til å undersøke leveren fungerer49,50,51,52, mangler disse cellene generelt viktig og grunnleggende funksjoner hepatocytes normal, som uttrykk for albumin (Figur 3). Det er allment kjent, derfor at utnytte primære hepatocytter er en verdifull mulighet for å undersøke leveren fysiol…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Joonbae Seo og Vivian Hwa for sine vitenskapelige inngang og diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. ble støttet av VIPs fra Japan vitenskap og teknologi byrå. En del av denne studien ble støttet av et stipend fra NIH (P30DK078392) for fordøyelses sykdommer forskning Core Center i Cincinnati.
HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
Fine scissors and forceps |