这里我们描述了一种使用果蝇S2R+ 细胞的收缩力测定方法。外源配体, 折叠肠 (雾) 的应用, 导致了雾信号通路和细胞收缩力的活化。该方法可用于研究雾信号通路中细胞收缩蛋白的调节。
我们开发了一种基于细胞的检测方法, 使用果蝇细胞概括顶端收缩由折叠的肠 (雾), 分泌上皮 morphogen 发起。在这项试验中, 雾被用作一种激动剂, 通过信号级联, 其中包括 G 蛋白耦合受体 (薄雾), Gα12/13蛋白 (铁丝网/Cta), 和一个 PDZ 域包含鸟嘌呤核苷酸交换因子 (RhoGEF2) 激活。雾信号导致肌动蛋白细胞骨架的迅速和戏剧性的重组形成一个收缩的钱包字符串。可溶性雾是从一个稳定的细胞线收集和应用 ectopically 到 S2R+ 细胞, 导致形态学变化, 如顶端收缩, 一个过程中观察到的发展过程, 如肠。这种检测方法适于高通量筛选, 而且利用 rna 干扰, 可以帮助识别这一途径中的其他基因。
用遗传模型生物体进行胚胎发生的研究对我们理解细胞如何组装成组织是非常宝贵的。对果蝇的研究, 尤其导致了关键基因和生物学原理的鉴定, 它引导生物体的形态发生和发育, 从受精到成年1,2,3. 在与果蝇进行的遗传学研究的同时, 从果蝇组织获得的培养细胞系也成为一个强有力的系统来处理各种分子和细胞生物学问题4,5,6.果蝇组织培养细胞对维持的要求最低, 因为它们在室温下培养, 没有 CO2。因此, 它们是适合高分辨率成像, 他们有高度的敏感性基因抑制的 rna 干扰6,7。许多团体使用果蝇组织培养细胞作为一种工具来发现相关基因定义细胞形态, 骨架动力学, 生存能力, 吞噬功能, 信号转导通路4,8, 9,10,11。当作为一个模型, 与整个动物, 养殖果蝇细胞线提供了一套非常互补的方法, 加快识别重要的分子的发展, 并提供一个框架, 其中确定他们的机械角色12。在这里, 我们描述了一种基于细胞的检测方法, 研究通过折叠-肠 (雾) 通路13,14触发顶端收缩的信号通路。这种基于细胞的收缩力检测方法允许研究人员研究雾化信号通路和调节非肌球蛋白 II 收缩力的分子机制。
早期果蝇胚胎的肠已被研究多年, 作为一种遗传模型的上皮形态发生和细胞从上皮细胞过渡到间充质的身份。肠的关键事件之一是在15、16、17、18形状的胚胎腹侧中线形成的上皮细胞子集的形态发生。这种简单的细胞形态变化导致推定的胚层细胞内化, 并由非肌球蛋白 II 的运动活动驱动, 收缩肌动蛋白网络16,19,20。数十年的基因研究已经确定了这一通路的分子成分, 并按顺序将它们排列在下面: 1) 从腹中线上皮细胞的顶端区域分泌出雾;2) 雾与 g 蛋白耦合的共受体、薄雾和烟雾结合, 并通过含有 Gα12/13亚单位铁丝网 (Cta) 的 heterotrimeric g 蛋白复合物发出信号, 这是由非规范的全球环境基金 Ric-8 陪护的;3) Cta 激活鸟嘌呤核苷酸交换因子 RhoGEF2, 进而激活小 G 蛋白 Rho1;4) Rho1 激活蛋白激酶 (韩);5) 韩国通过调节光链 (RLC) 的磷酸化来激活顶端域的非肌球蛋白 II 收缩力, 从而产生顶端收缩 (图 1)15、21、22 ,23,24,25,26,27,28,29。这些成分中的突变会干扰正常的肠和其他形态发生运动, 包括翼盘和唾液腺的形成, 表明这条通路在果蝇的几个阶段被使用。胚胎发生30,31,32。雾通路是最受研究的上皮整形模型之一, 并提供了重要的洞察力如何从基因转录调控细胞细胞运动14,15 的组织级形态发生 ,21。
我们开发了一种基于细胞的收缩力检测方法, 概括了在开发飞胚17中观察到的雾下游的许多细胞反应。我们设计了一个稳定的 S2 细胞线, 表示在它的 C 总站标记的雾在一个可诱导的 metallothionine 启动子的控制下, 可以收获后, 添加硫酸铜 (丘索4) 到培养基。当雾条件的媒介被应用 ectopically 对 S2 受体 + (S2R+) 细胞, 这是 S2 细胞的亚系, 区别于它们的受体的差异表达, 如卷曲和整合素亚基, 细胞经历重组的细胞骨架高度令人联想到顶端收缩12,17,27,33。这些变化可以通过相对比显微镜观察到, 在这种情况下, 雾处理导致了相色褶边的出现, 表明在非肌球蛋白 II 收缩力的径向增加, 或通过荧光显微镜在那里雾处理导致表达 EGFP 标记 RLC34的细胞中非肌球蛋白 II. 型环的形成。这些环含有肌球蛋白磷酸化调节光链 (pRLC) 可见通过染色23,34,35。这种雾引起的反应需要 Cta, RhoGEF2, 洛, 和韩国;因此, 利用重组的 S2R+ 和细胞, 我们建立了一种方法来研究雾诱导的收缩在组织-文化为基础的系统24,25,34。
在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以细胞为基础的收缩力试验使用果蝇组织培养细胞线 (S2R+ 细胞), 经历非肌球蛋白 II 收缩作为回应雾信号。这种检测方法对于研究雾化通路以及调节非肌球蛋白 II 收缩力的机制是有用的。
细胞培养注意事项:
S2R+ 细胞的维持条件对于从该检测中获得可靠数据至关重要。当计划执行收缩力试验时, 最好保持 S2R+ 细胞在盾牌和 M3 昆虫培养基。虽然 S2R+ 细胞可以在其他昆虫细胞培养媒介 (如SF900 或施耐德的昆虫培养基) 中茁壮成长, 但它们往往会失去对雾的反应。S2R+ 细胞有很高的通道数, 一般超过 20-25 通道, 开始失去对 rna 干扰的敏感性。最好使用早期通道细胞进行所有实验。干扰损耗实验的另一个重要方面是选择适当的控制。常见的阴性控制包括 dsRNA 靶向 EGFP 或 pBlueScript, 两者都与苍蝇基因组没有同源性。靶向蛋白在雾通路 (洛, 韩等), 其中, 当耗尽, 防止激活非肌球蛋白收缩力, 也是有用的控制。S2:Fog-Myc 细胞可以保持在替代细胞培养培养基, 如 SF900 补充100单位/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素, 0.25 两性霉素 b. 注意在 SF900 培养细胞时不需要使用血清。细胞密度也是果蝇组织培养细胞各方面的重要组成部分。与哺乳动物组织培养细胞不同,果蝇衍生的组织培养细胞在较高的细胞密度下生长得最好 (密度不低于 5 x 105细胞/毫升)。然而, 当进行这项化验时, 关键的是, 细胞没有被镀在一个涂层玻璃底菜超过80% 汇合, 因为定量的收缩与非收缩细胞将变得极其乏味。
细胞收缩力测定的关键方面和替代方法:
雾的生产, 触发非肌球蛋白 II 收缩力的配体, 是这项试验的一个关键组成部分。雾基因对730种氨基酸的蛋白质进行编码, 预测的分子量为 78 kDa26。Hydropathy 分析显示, 在雾的氨基端有12疏水性残留物, 可以作为分泌信号序列。此外, 编码序列还包含多个站点的潜在 n-和 O 链接糖基化, 进一步建议雾是分泌蛋白26。为支持这一点, 雾被局部化为分泌囊泡在假定表皮细胞接受顶端收缩16。在培养基中加入硫酸铜后, 产生了雾-c-myc 的表达, 而抗雾或 c-myc 抗体则从诱导培养培养基中提取出 150 kD 蛋白, 而不是从 S2 细胞的诱导培养基中提取。这一分子量高于预测的 80 kD 的雾分子量, 表明 S2 细胞分泌机械在胞吐作用之前可能 glycosylate 蛋白质。由于雾净化的潜在变异, 在所有实验中使用同一批雾化条件介质是可取的。制作大量浓雾–c-myc 介质将有助于保持整个实验的一致性。
这种化验方法的成功还取决于有信心地识别已经历收缩的细胞。虽然收缩细胞可以通过荧光显微镜观察, 通过染色肌动蛋白或非肌球蛋白 II, 最可靠的方法来识别和量化收缩细胞是通过相对比或 DIC 显微镜。在大多数标准光学显微镜上, 使用 20X-40X 放大倍数可以实现精确计数。尽管这里写的协议使用的是玻璃底菜, 但也可以使用标准的1.5 玻璃盖玻片涂上 A。添加雾可以在35毫米的组织培养上的盖玻片放置在 parafilm, 以限制每种化验所用的雾量。固定质量是检测的一个重要组成部分, 因为固定细胞的不良会导致误报。使用新鲜的固定液和确保细胞不干燥一旦固定将导致更可靠的结果。最后, 对大量的单元数进行计数是很重要的。通常情况下, 只有 30%-50% 的未经治疗或控制的 rna 治疗细胞收缩后, 雾的灌注。然而, 在 S2R+ 细胞中出现了基础性的收缩, 因此需要大量的细胞来确保收缩细胞的分数的任何变化都是由治疗引起的。此外, 在调节非肌球蛋白 II 收缩的部分蛋白质的消耗可能导致超收缩性, 即使在没有雾。这里提供的数据来自3600多个细胞, 在三个连续的 rna 干扰处理中, 使用同一批次的雾条件介质进行计数。
细胞收缩力测定的应用:
这种收缩力分析, 当加上 rna 筛选方法, 提供了一个强大的系统来研究细胞信号, 形态发生和细胞收缩力。以前, 它已经被用来识别两个雾共受体之一21。通过在 S2R+ 细胞中进行 rna 干扰, 对138克蛋白偶联受体 (受体) 进行靶向筛查, 并根据此处介绍的协议, 测定其对雾反应的能力。在138受体中, 一个先前 uncharacterized 的基因, 现在被称为薄雾, 被发现。对薄雾功能的进一步研究表明, S2R+ 细胞不仅需要雾诱导的细胞收缩力, 而且肠在果蝇21的发育中也是必不可少的。此外, 这一分析被用来证明 Ric-8, 一个非规范的全球环境基金, 也是雾信号通路27中的一个组成部分。一系列的上位 rna 干扰实验和收缩力试验表明, Ric-8 与 Gα12/13亚基 Cta 和功能, 以本地化它在细胞内, 这是关键的雾诱导细胞收缩力31.
果蝇组织培养非常适合初学者, 因为细胞在室温下很容易保持, 不需要 CO2或缓冲细胞培养培养基, 只要保持适当的细胞培养密度, 就能强健。细胞收缩试验成功地由实验室部分进行的本科生细胞生物学课程, 在那里的学生几乎没有任何经验, 培养细胞或显微镜。这里提出的细胞收缩力检测是一个强大的, 细胞基础的工具, 可用于基因发现, 或询问雾信号通路, 帮助我们更好地了解发展过程, 如顶端收缩和非肌球蛋白 II. 收缩, 一般。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢罗杰斯实验室和白苹实验室的成员, 以及里德学院2018春季细胞生物学课程的学生, 他们为这个协议的发展做出了贡献。此外, 作者希望感谢丽思实验室的成员仔细阅读和编辑这篇手稿。该出版物的研究报告得到了国家科学基金会的支持, 716964 号奖项由 D.A.A. 和 A.R. 和里德学院生物系提供。
S2R+ cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | cell culture line, undergoes apical constriciton |
S2:Fog-myc cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter |
S2R+ :Sqh-EGFP cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP |
Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | cell culture medium |
SF900 insect medium | Thermofisher Scientific | 12658019 | alternative cell cutlure medium |
Schneider’s insect medium | Thermofisher Scientific | 21720024 | alternative cell cutlure medium |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 16000044 | media supplement |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermofisher Scientific | 15240112 | antimicrobial/antifugal media supplement |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion |
Glass bottom plates | Maktek | P35G-1.5-10 | used for assay and for fixing and staining cells |
Glass cover slips | Corning | 2940-225 | alternative to glass bottom dishes |
Protein concentrators | Millipore | UFC903008 | 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media |
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | used to culture cells |
6-well and 12-well tissue culture dishes | Genessee | 25-105, 25-106 | used to culture cells |
Flourescent mounting medium | Dako | S3023 | to preserve fixed cells |
32% Paraformaldehyde | EMS | 15714-S | used to fix cells |
Pipes | EMS | 19240 | used in PEM buffer for cell fixation |
Anti-Myc Antibody | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | used to dectect Fog-Myc |
PhosphoSerine-19 antibody | Cell Signaling | 3671 | antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19 |
488-Phalloidin, 568-Phalloidin | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | to stain for f-actin |
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system | VisiTech International | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells | |
Eclipse TE300 Inverted microscope | Nikon | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells |