Analisi del ciclo cellulare nella linea germinale di c. elegans con la timidina analogico EdU
Summary
È descritto un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per identificare la fase S e analizzare le dinamiche del ciclo cellulare in c. elegans ermafrodita germinale utilizzando la timidina EdU analogico. Questo metodo non richiede nessun transgeni ed è compatibile con la macchiatura immunofluorescente.
Abstract
Analisi del ciclo cellulare negli eucarioti utilizza frequentemente la morfologia del cromosoma, espressione e/o localizzazione di prodotti genici necessari per le varie fasi del ciclo cellulare, o l’incorporazione di analoghi nucleosidici. Durante la fase S, polimerasi del DNA incorporare gli analoghi della timidina come EdU o BrdU nel DNA cromosomico, marcatura delle cellule per l’analisi. Per c. elegans, il nucleoside analogico EdU durante regolare cultura è alimentata con i vermi ed è compatibile con tecniche di immunofluorescenza. La linea germinale di c. elegans è un sistema potente modello per gli studi di segnalazione vie, cellule staminali, meiosi e ciclo cellulare perché è trasparente, geneticamente facile e Profase Meiotica e differenziazione cellulare/gametogenesi si verificano in un lineare Assemblea-come la moda. Queste caratteristiche rendono EdU un ottimo strumento per studiare aspetti dinamici delle cellule mitoticamente ciclismo e sviluppo di germline. Questo protocollo viene descritto come correttamente preparare EdU batteri, nutrirli wild-type c. elegans ermafroditi, sezionare la gonade ermafrodita, macchia per EdU incorporazione nel DNA, macchia con gli anticorpi per rilevare vari ciclo cellulare e gli indicatori dello sviluppo, la gonade di immagine e analizzare i risultati. Il protocollo descrive le variazioni nel metodo e nell’analisi per la misurazione della fase S indice, M-fase indice, G2 durata, durata del ciclo cellulare, tasso di entrata meiotica e tasso di progressione della Profase Meiotica. Questo metodo può essere adattato per studiare il ciclo cellulare o la storia di cella in altri tessuti, fasi, ambiti di provenienza genetici e condizioni fisiologiche.
Introduction
Nello sviluppo animale, centinaia, migliaia, milioni, miliardi o anche migliaia di miliardi di divisioni cellulari è necessari per formare l’organismo adulto. Il ciclo cellulare, il set di eventi cellulari composto di G1 (gap), S (sintesi), G2 (gap), e M (mitosi) definire la serie di eventi che vengono eseguiti ogni divisione cellulare. Il ciclo cellulare è dinamico e meglio apprezzato in tempo reale, che può essere tecnicamente difficile. Le tecniche presentate in questo protocollo permettono di effettuare le misurazioni delle fasi e la tempistica del ciclo cellulare da immagini fisse.
Etichettatura con analoghi nucleosidici come 5-Etinil-2′-deoxyuridine (EdU) o 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) è il gold standard per identificare la fase S negli studi della dinamica del ciclo cellulare nell’adulto Caenorhabditis elegans (c. elegans) germline ermafroditi1,2,3,4,5. EdU sia BrdU utilizzabile in quasi qualsiasi background genetico, come che non si basano su qualsiasi costrutto genetico. Visualizzazione di BrdU richiede duro trattamento chimico per esporre l’antigene per l’anticorpo anti-BrdU colorazione, che spesso è incompatibile con la valutazione di altri markers cellulari visualizzati dalla co-macchiatura con altri anticorpi. Al contrario, visualizzazione EdU si verifica dalla chimica clicca in condizioni blande e quindi è compatibile con l’anticorpo co-macchiatura6,7.
La specificità dell’etichetta è chiara, dal momento che i nuclei solo incorporano gli analoghi (5-Etinil-2′-deoxyuridine) della timidina in DNA durante la fase S. Visualizzazione avviene nel tessuto fisso. L’etichetta di EdU è invisibile da solo fino a un colorante contenenti azide o fluorophore reagisce covalentemente con alchini in EdU di rame-catalizzata clic chimica8. EdU etichettatura può fornire informazioni immediate su cui i nuclei sono in fase S, utilizzando un breve impulso di etichettatura. EdU possono anche fornire informazioni dinamiche, utilizzando pulse-chase o etichettatura continuo; ad esempio, in un esperimento di pulse-chase, l’etichetta è diluita a ogni divisione cellulare o propagate come nondividing cellule progresso attraverso lo sviluppo.
C. elegans ermafrodita germinale è un sistema potente modello per gli studi del ciclo cellulare, cellule staminali, meiosi e vie di segnalazione. La linea germinale adulta è una linea di assemblaggio polarizzata con cellule staminali presenti all’estremità distale, seguita da voce e progressione attraverso Profase Meiotica, coordinato con le fasi della gametogenesi più prossimalmente (Figura 1). L’estremità prossimale, ovociti maturo, sono ovulati e fertilizzato e cominciano l’embriogenesi nel utero9,10,11. La regione lungo ~ 20 cella-diametro accanto alla cella di punta distale, che include il gambo di germline mitotically ciclismo, cellule progenitrici e le cellule di S-fase meiotiche ma non le cellule in Profase Meiotica, viene chiamata il progenitore zona2,4 , 9 , 12. le membrane delle cellule forniscono incompleta separazione tra i nuclei la linea germinale distale, ma la zona cellule progenitrici subiscono mitotica cellulare ciclismo in gran parte in modo indipendente. La durata mediana ciclo cellulare mitotica delle cellule di zona progenitrici di germline in giovane adulti ermafroditi è ~6.5 h; Fase G1 è breve o assente, e quiescenza non è osservato1,2,13. Differenziazione delle cellule staminali germinali si verifica attraverso la differenziazione essenzialmente diretta e quindi manca di transito-amplificando divisioni4. Durante la differenziazione nel pachitene, circa 4 su 5 nuclei non si formano gli ovociti ma invece andare incontro ad apoptosi, in qualità di infermiera cellule donando loro contenuto citoplasmatico di sviluppo dell’ovocita12,14 , 15.
Oltre alle etichette cellule in fase S con analoghi nucleosidici, si possono identificare le cellule in mitosi e meiosi usando la macchiatura dell’anticorpo. Nuclei in mitosi sono immunoreactive all’anti-fosfo-istone H3 (Ser10) anticorpo (chiamato pH3)7,16. Nuclei in meiosi sono immunoreactive all’anticorpo anti-lui-3 (una proteina di asse meiotic del cromosoma)17. I nuclei nella zona del progenitore possono essere identificati dall’assenza di HIM-3, la presenza di adrenocorticale REC-818o la presenza di WAPL-119. WAPL-1 intensità è massima nella gonade somatica, alta nella zona del progenitore e basso durante i primi meiotica prophases19. Diverse misurazioni del ciclo cellulare sono possibili con poche variazioni nel protocollo: I) identificare i nuclei in fase S e misurare l’indice di S-fase; II) identificare i nuclei in fase M e misurare l’indice di fase M; III) determinano se i nuclei erano nella S-fase mitotica o meiotica; IV) misurare la durata di G2; V) misura la duartion delle fasi G1 + G2 + M; VI) misura il tasso di entrata meiotica; VII) stimare il tasso di progressione meiotica.
Si possono fare misurazioni multiple del ciclo cellulare da solo alcuni tipi di esperimenti di laboratorio bagnato. Il protocollo sottostante descrive un 30 min impulso etichettatura alimentandosi di c. elegans adulti ermafroditi con EdU etichettato batteri e cellule co-etichettatura di M-fase macchiando con progenitore e degli anticorpi anti-pH3 zona cellule macchiando con anticorpo anti-WAPL-1. Soltanto i cambiamenti nella durata della EdU feed (punto 2.5), tipo di anticorpi impiegati (punto 5), e sono necessarie per le misure ulteriori analisi (punto 8.3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparazione di EdU-identificati batteri (passaggio 1) è critica per questo protocollo e il primo punto della risoluzione dei problemi. Etichetta di selvaggio-tipo giovane adulto ermafroditi molto affidabile in un 4h EdU-impulso, rendendo questo un controllo utile per ogni nuovo lotto di EdU-identificati batteri. Inoltre, intatti EdU-etichetta per i batteri che entrano l’intestino (in più vecchi animali o alcuni mutanti difettosi faringe/smerigliatrice) verranno etichettare con clic chimica e appaiono come brillante pu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al centro stock di e. coli per MG1693; WormBase; il centro di genetica di Caenorhabditis che è finanziato dai nazionali istituti di salute di ricerca infrastrutture programmi di Office (P40OD010440) per i ceppi; Zach Pincus per consulenza statistica; Aiping Feng per reagenti; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar e John Brenner per formazione, consulenza, supporto e discussioni utili; e i laboratori Kornfeld e Schedl per feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 a KK, R01 GM100756 TS] e una borsa di dottorato National Science Foundation [DGE-1143954 e DGE-1745038 a ZK]. Il National Institutes of Health, né la National Science Foundation ha avuto alcun ruolo nella progettazione di studio, raccolta, analisi e interpretazione dei dati, né per iscritto il manoscritto.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
References
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