تحليل دورة الخلية في Germline C. ايليجانس مع إيدو التناظرية Thymidine
Summary
يتم وصف أسلوب التصوير القائم التي يمكن استخدامها لتحديد المرحلة S وتحليل ديناميات دورة الخلية في germline خنثي C. ايليجانس استخدام thymidine في إيدو التناظرية. هذا الأسلوب يتطلب لا المتسلسلات ومتوافق مع صبغة إيمونوفلوريسسينت.
Abstract
وكثيراً ما يستخدم تحليل دورة الخلية في حقيقيات النوى مورفولوجيا كروموسوم والتعبير و/أو الترجمة من منتجات الجينات المطلوبة لمختلف مراحل دورة الخلية، أو الإدماج من النظير نوكليوزيد. خلال المرحلة S، دمج بولمرس الحمض النووي النظير thymidine مثل إيدو أو بردو الصبغية الحمض النووي، وتمييز الخلايا لتحليلها. C. ايليجانس، نوكليوزيد إيدو التناظرية يتغذى على الديدان خلال الثقافة العادية ومتوافق مع تقنيات إيمونوفلوريسسينت. الفعل من C. ايليجانس نظام نموذج قوي للدراسات يشير إلى مسارات، والخلايا الجذعية، والانقسام، ودورة الخلية لأنها شفافة وسهلة وراثيا، وهو الطور الأول والتمايز الخلوي/الجاميطات التي تحدث في خطي الجمعية مثل الأزياء. هذه الميزات تجعل إيدو أداة عظيمة لدراسة الجوانب الحيوية للخلايا ركوب ميتوتيكالي والتنمية germline. هذا البروتوكول توضح كيفية إعداد البكتيريا إيدو بنجاح، وإطعامهم إلى البرية من نوع C. ايليجانس المنحرفين، تشريح الغدد التناسلية خنثي، ووصمة عار لإدماج إيدو في الحمض النووي، وصمة عار مع الأجسام المضادة للكشف عن مختلف دورة الخلية و صورة الغدد التناسلية علامات التنموية، وتحليل النتائج. البروتوكول توضح الاختلافات في الأسلوب والتحليل لقياس S-المرحلة مؤشر م-المرحلة الفهرس G2 المدة، مدة دورة الخلية، ومعدل الدخول هو، ومعدل تطور الطور الأول هو. هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف مع دراسة دورة الخلية أو التاريخ الخلية في الأنسجة ومراحل والخلفيات الوراثية والظروف الفسيولوجية الأخرى.
Introduction
في مجال التنمية الحيوانية، ملزمون بمئات الآلاف، والملايين، المليارات أو حتى تريليونات من انقسامات الخلية شكل الكائن الحي الكبار. دورة الخلية، تتكون مجموعة الأحداث الخلوية من G1 (الفجوة)، S (توليف)، G2 (الفجوة)، وتعريف M (الانقسام) السلسلة من الأحداث التي يتم تنفيذها كل انقسام الخلية. دورة الخلية من دينامية وتقدير أفضل في الوقت الحقيقي، الذي يمكن أن يكون صعباً من الناحية التقنية. تسمح التقنيات المعروضة في هذا البروتوكول بإجراء قياسات المراحل وتوقيت دورة الخلية من الصور لا تزال.
وضع العلامات مع النظير نوكليوزيد مثل 5-اثينيل-2 ‘–ديوكسيوريديني (إيدو) أو 5-برومو-2’–ديوكسيوريديني (بردو) هو معيار الذهب لتحديد مرحلة ثانية في الدراسات المتعلقة بديناميات دورة الخلية في الكبار ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) خنثي germline1،2،3،،من45. إيدو وبردو يمكن استخدامها في أي ما يقرب من الخلفية الوراثية، كما أنها لا تعتمد على أي التركيب الوراثي. تصور بردو يتطلب المعالجة الكيميائية قاسية للكشف عن المستضد لجسم بردو مكافحة تلطيخ، الذي غالباً ما يكون غير متوافق مع تقييم علامات خلوية أخرى تصور تلطيخ يشترك مع الأجسام المضادة إضافية. على النقيض من ذلك، تصور إيدو يحدث عن طريق الكيمياء فوق تحت ظروف معتدلة وهكذا متوافق مع جسم تلطيخ شارك6،7.
خصوصية التسمية من الواضح منذ فقط دمج نويات النظير (5-اثينيل-2 ‘–ديوكسيوريديني) thymidine في الحمض النووي خلال المرحلة S. التصور يأخذ مكان في الأنسجة الثابتة. التسمية إيدو غير مرئي بنفسها حتى صبغة المحتوية على أزيد أو fluorophore يتفاعل تساهمي مع ألكاين في إيدو التي حفزت النحاس فوق الكيمياء8. وسم إيدو يمكن توفير المعلومات الفورية التي نواة في المرحلة S، استخدام نبضة قصيرة من وضع العلامات. إيدو يمكن أيضا تقديم معلومات حيوية، استخدام نبض–تشيس أو وسم المستمر؛ على سبيل المثال، في تجربة نبض–تشيس، التسمية هو المخفف في كل انقسام الخلية أو نشر نونديفيدينج كما تقدم الخلايا عن طريق التنمية.
Germline خنثي C. ايليجانس نظام نموذجي قوية للدراسات يشير إلى مسارات، والخلايا الجذعية، والانقسام، ودورة الخلية. Germline الكبار خط تجميع استقطاب مع الخلايا الجذعية التي وجدت في نهاية القاصي متبوعاً بالدخول والتقدم من خلال هو الطور الأول، بالتنسيق مع مراحل للجاميطات أكثر بروكسيمالي (الشكل 1). في نهاية الدانية، بويضات ناضجة وهي أوفولاتيد والمخصبة وتبدأ امبريوجينيسيس في الرحم9،،من1011. تسمى منطقة طويلة ~ 20 الخلية قطرها قرب الخلية الحافة البعيدة، التي تشمل الجذعية germline ركوب ميتوتيكالي، وخلايا السلف وهو S-مرحلة الخلايا لكن لا الخلايا في الطور الأول هو،2،منطقة السلف4 , 9 , 12-توفير أغشية الخلية فصل غير كامل بين الأنوية في germline القاصي، ولكن الخلايا منطقة السلف الخضوع للخلية الانقسامية ركوب الدراجات بشكل مستقل إلى حد كبير. مدة دورة الخلية الانقسامية متوسط الخلايا منطقة السلف germline في الشباب المنحرفين الكبار ح ~6.5؛ المرحلة G1 مختصر أو غائبا، ولا يحترم التتابع1،2،13. يحدث من خلال التمايز المباشر أساسا تمايز الخلايا الجذعية Germline ومما يفتقر إلى تضخيم عبور الشعب4. خلال التمايز في مرحلة باتشيتيني، حوالي 4 من أصل 5 نويات لن يشكل بويضات لكن بدلاً من الخضوع للمبرمج، بوصفها ممرضة الخلايا عن طريق التبرع بمحتوياتها هيولى إلى12،البويضات النامية14 , 15.
بالإضافة إلى وضع العلامات من الخلايا في مرحلة ثانية مع النظير نوكليوزيد، واحد تحدد الخلايا في الانقسام والانقسام الاختزالي استخدام تلطيخ جسم. نوى في الانقسام يتم إيمونوريكتيفي لمكافحة–والرمات–هيستون H3 (Ser10) جسم (تسمى pH3)7،16. نوى في الانقسام الاختزالي إيمونوريكتيفي إلى جسم المناهضة له-3 (بروتين كروموسوم هو محور)17. يمكن التعرف على النوى في منطقة السلف بغياب سموه-3، ووجود نوكليوبلاسميك REC-818، أو وجود وابل-119. كثافة وابل-1 أعلى في الغدد التناسلية الجسدية، عالية في المنطقة، والسلف ومنخفضة خلال وقت مبكر بروفاسيس هو19. عدة دورة الخلية القياسات الممكنة مع عدد قليل من الاختلافات في البروتوكول: أنا) تحديد الأنوية في مرحلة ثانية، وقياس مؤشر S-المرحلة؛ ثانيا) تحديد الأنوية في مرحلة م وقياس مؤشر المرحلة م؛ ثالثا) تحديد ما إذا كانت نواة الانقسامية أو هو S-المرحلة؛ رابعا) قياس مدة G2؛ V) قياس دوارتيون G2 + M + G1 المراحل؛ سادسا) قياس معدل دخول هو؛ سابعا) تقدير معدل التقدم هو.
يمكن للمرء أن قياسات دورة الخلية متعددة من أنواع قليلة من تجارب مختبر الرطب. البروتوكول أدناه وصف نبض 30 دقيقة وسم بتغذية C. ايليجانس الكبار المنحرفين مع إيدو المسماة البكتيريا وشارك التوسيم م-مرحلة الخلايا تلطيخ الخلايا المنطقة مع الأجسام المضادة-pH3، والسلف تلطيخ مع الأجسام المضادة-وابل-1. التغييرات فقط في فترة إيدو آر (الخطوة 2، 5)، نوع من الأجسام المضادة المستخدمة (الخطوة 5)، وتحليلات (الخطوة 8.3) المطلوبة للقياسات الإضافية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعداد البكتيريا المسماة إيدو (الخطوة 1) أمر حاسم لهذا البروتوكول، والنقطة الأولى لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. الشباب المنحرفين الكبار البرية من نوع التسمية جداً موثوق في ح 4 نبض إيدو، مما يجعل هذا عنصر تحكم مفيدة لكل دفعة جديدة من البكتيريا المسماة إيدو. بالإضافة إلى ذلك، سوف تسمية مع الكيمي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لمركز الأسهم كولاي على MG1693؛ وورمباسي؛ مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس الذي تموله الوطنية معاهد للصحة للبحوث البنية التحتية برامج Office (P40OD010440) لسلالات؛ بينكوس زاك للمشورة الإحصائية؛ قد فنغ للمواد الكيميائية؛ لوك شنايدر وشارف أندريا سانديب كومار برينر جون للتدريب والمشورة، والدعم، ومناقشة مفيدة؛ ومختبرات كورنفيلد و Schedl لردود الفعل على هذه المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في “المعاهد الوطنية للصحة” [R01 AG02656106A1 إلى، GM100756 R01 للملخص] وزمالة “مؤسسة العلوم الوطنية” بريدوكتورال [دج-1143954 و 1745038 تأيين لصنع]. المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة العلوم الوطنية لا بأي دور في تصميم الدراسة، وجمع وتحليل وتفسير البيانات، ولا في كتابة المخطوطة.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
References
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
- Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
- Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
- ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
- Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
- Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
- Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
- Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
- Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
- Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
- Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
- Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
- Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
- Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
- Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
- Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
- Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
- . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
- Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).
