Cellen syklus analyse i C. elegans Germline med Thymidine Analog EdU
Summary
En imaging-basert metode beskrives som kan brukes til å identifisere S-fase og analysere celle syklus dynamikk i C. elegans Hermafroditt germline bruke thymidine analoge EdU. Denne metoden krever ingen effekter av transgener og er kompatibel med immunofluorescent flekker.
Abstract
Cellen syklus analyse i eukaryoter benytter ofte kromosom morfologi, uttrykk og/eller lokalisering av genet produkter kreves for ulike faser av cellen syklus, eller innlemmelse av nukleosid analogs. I S-fasen innlemme DNA polymerases thymidine analogs som EdU eller BrdU i chromosomal DNA, merke celler for analyse. For C. elegans, nukleosid analoge EdU mates til ormer under vanlige kultur og er kompatibel med immunofluorescent teknikker. Germline C. elegans er et kraftig modellsystem for studiene signalnettverk trasé, stilk celler, meiose og celle syklus fordi det er gjennomsiktig, genetisk lettvinte, og meiotic prophase og cellulære differensiering/gametogenesis oppstår i en montering-lignende lineært. Disse funksjonene gjør EdU en stor verktøyet å studere dynamisk aspekter av mitotically sykling celler og germline utvikling. Denne protokollen beskriver hvordan å forberede EdU bakterier, mate dem til vill-type C. elegans hermafroditter, dissekere den Hermafroditt gonad, stain for EdU inkorporering DNA, flekker med antistoffer å oppdage ulike cellen syklus og utviklingsmessige markører, bildet i gonad og analysere resultatene. Protokollen beskriver variasjoner i metoden og analyse for måling av S-fase indeks, M-fase indeks, G2 varighet, celle varighet, rate av meiotic oppføring og hastighet på meiotic prophase progresjon. Denne metoden kan tilpasses for å studere i cellen syklus eller cellen historie i andre vev, stadier, genetisk bakgrunn og fysiologiske forhold.
Introduction
I animalske utvikling må hundrevis, tusenvis, millioner, milliarder eller selv billioner av celledelinger danne voksen organisme. Cellen syklusen, utvalget av mobilnettet hendelser består av G1 (mellomrom), S (syntese), G2 (mellomrom), og M (mitose) definerer serien av hendelser kjøres hver celledeling. Cellen syklusen er dynamisk og best verdsatt i sanntid, som kan være teknisk vanskelig. Teknikker som presenteres i denne protokollen tillater en å lage målinger av faser og timing av cellen syklus fra stillbilder.
Merking med nukleosid analogs som 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) eller 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) er gull standard å identifisere S-fase i studiene i cellen syklus dynamikk i den Caenorhabditis elegans (C. elegans) voksen Hermafroditt germline1,2,3,4,5. Både EdU og BrdU kan brukes i nesten alle genetisk bakgrunn, som de ikke stole på noen genetiske konstruksjon. Visualisere BrdU krever sterke rengjøringsmidler å avsløre antigen for anti-BrdU antistoff flekker, som er ofte uforenlig med vurdering av andre cellulære markører visualisert ved co farging med ytterligere antistoffer. Derimot visualisere EdU oppstår ved klikk kjemi under mild forhold og dermed er kompatibel med antistoff co flekker6,7.
Spesifisiteten av etiketten er klart siden kjerner bare inkludere thymidine (5-ethynyl-2-deoxyuridine) analogs inn DNA i S-fasen. Visualisering foregår i fast vev. EdU etiketten er usynlig i seg selv til en azide som inneholder fargestoff eller fluorophore reagerer covalently med alkyne i EdU av kobber-katalysert Klikk kjemi8. EdU merking kan gi umiddelbar informasjon som kjerner er i S-fase, med en kort puls av merking. EdU kan også gi dynamisk informasjon, puls-jage eller kontinuerlig merking; for eksempel i en puls-jage eksperimentet, etiketten er utvannet på hver celledeling eller overført som nondividing celler fremgang gjennom utvikling.
C. elegans Hermafroditt germline er en kraftig modellsystem for studiene signalnettverk trasé, stilk celler, meiose og celle syklus. Den voksne germline er en polarisert samlebåndet med stamceller finnes på den klubbeformede enden etterfulgt av oppføringen og progresjon gjennom meiotic prophase, koordinert med stadier av gametogenesis mer proximally (figur 1). Ved den proksimale enden, oocytes modnes, er ovulated og befruktet og begynne embryogenesis i livmoren9,10,11. ~ 20 celle-diameter lang regionen nær den distale cellen, som inkluderer mitotically sykling germline stammen, stamfar celler og meiotic S-fase celler men ikke cellene i meiotic prophase, kalles stamfar sone2,4 , 9 , 12. cellemembraner gir ufullstendig skille mellom kjerner i den distale germline, men stamfar sonen cellene gjennomgår mitotisk celle sykling stort sett selvstendig. Median mitotisk celle syklus varigheten av germline stamfar sonen celler i ung voksen hermafroditter er ~6.5 h; G1 er kort eller fraværende, og gågaten er ikke observert1,2,13. Germline stem celledifferensiering skjer gjennom egentlig direkte differensiering og dermed mangler transitt-forsterke divisjoner4. Under differensiering pachytene Stadium, ca 4 ute av 5 kjerner vil ikke danne oocytes men i stedet gjennomgår apoptose, fungerer som sykepleier celler ved å donere cytoplasmatiske innholdet utvikling oocyte12,14 , 15.
I tillegg til merking celler i S-fase med nukleosid analogs, kan en finne cellene i mitose og meiose bruker antistoff flekker. Kjerner i mitose er immunoreactive til anti-phospho-histone H3 (Ser10) antistoff (kalt pH3)7,16. Kjerner i meiose er immunoreactive til anti-ham-3 antistoff (en meiotic kromosom aksen protein)17. Kjerner i sonen stamfar kan identifiseres ved fravær av HIM-3, tilstedeværelse av nucleoplasmic REC-818eller tilstedeværelse av WAPL-1-19. WAPL-1 intensitet er høyest i den somatisk gonad, høy i sonen stamfar, og lav under tidlig meiotic prophases19. Flere celle syklus målingene er mulig med noen få variasjoner i protokollen: jeg) identifisere atomkjerner i S-fase og måle S-fase index; II) identifiserer kjerner i M-fase og måle M-fase indeksen. III) fastslå om kjerner var i mitotisk eller meiotic S-fase; IV) mål varigheten av G2; V) måle duartion av G2 + M + G1 faser. VI) måle hastigheten meiotic inngangspunktet; VII) anslå av meiotic progresjon.
En kan lage flere celle syklus målinger for bare noen få typer våt-lab eksperimenter. Protokollen nedenfor beskriver en 30 min puls merking av fôring C. elegans voksen hermafroditter med EdU merket bakterier og co merking M-fase celler av flekker med anti-pH3 antistoffer og stamfar sonen celler av flekker med anti-WAPL-1 antistoff. Bare endringer i varigheten av EdU feed (trinn 2,5), type antistoffer ansatt (trinn 5), og analyser (trinn 8.3) kreves for flere målinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utarbeidelse av EdU-merket bakterier (trinn 1) er avgjørende for denne protokollen, og det første punktet for feilsøking. Vill-type unge voksne hermafroditter etikett veldig pålitelig i en 4 h EdU-puls, noe som gjør dette til en nyttig kontroll for hver nye batch EdU-merket bakterier. I tillegg vil intakt EdU-merket bakterier angir tarmen (i eldre dyr eller visse pharynx/jeksel defekt mutanter) merke med Klikk kjemi og vises som lyse avlang puncta i tarmen. En alternativ teknikk for merking hermafroditter bruker en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til E. coli lager center for MG1693; Wormbase; Caenorhabditis genetikk sentrum som er finansiert av den nasjonale institutter for helse Office av forskning infrastruktur programmer (P40OD010440) for stammer; Zach Pincus for statistiske råd; Aiping Feng for reagenser; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar og John Brenner for trening, råd, støtte og nyttig diskusjon; og Kornfeld og Schedl laboratorier for tilbakemelding på dette manuskriptet. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 til KK, R01 GM100756 til TS] og en National Science Foundation predoctoral fellesskap [DGE-1143954 og DGE-1745038 til ZK]. National Institutes of Health verken National Science Foundation ikke hadde noen rolle i utformingen av studien, innsamling, analyse og tolkning av data, eller skrive manuskriptet.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
References
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
- Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
- Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
- ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
- Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
- Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
- Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
- Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
- Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
- Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
- Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
- Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
- Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
- Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
- Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
- Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
- Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
- . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
- Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).
