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Genetics

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

Published: October 09, 2018
doi:
10.3791/58346
, , ,
1Molecular Physiology and Biophysics,Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology,University of Southern California

Summary

O9 1 は多能性マウス神経堤細胞株です。ここで O9 1 細胞を培養、特定の細胞型へ O9 1 細胞と分化および遺伝子 siRNA によるノックダウンや CRISPR Cas9 ゲノム編集による O9 1 セルを操作するための詳細なステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。

Abstract

神経堤細胞 (Ncc) は異なったセルタイプに区別でき、複数の組織や臓器に上昇を与える多能性幹細胞に移行しています。O9 の-1 セルの行は、内因性から派生したマウスの胚の Ncc とその率を維持します。ただし、特定のカルチャ条件下で O9 1 細胞は異なる種類の細胞に分化することができます、研究用途の広い範囲で利用します。最近では、マウスでの研究と O9 1 細胞研究の組み合わせであることを示したシグナリング経路エフェクタ ヤップおよび Taz 顎顔面神経堤由来で重要な役割を果たすカバ。O9 の-細胞培養プロセスは他の細胞よりも複雑ですが、O9 1 細胞ラインは Ncc体外を調査するため強力なモデルです。ここでは、異なる種類の細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞などに分化 O9 1 細胞のプロトコルと同様に、その、幹細胞性を維持するために O9 1 細胞株を培養するためのプロトコルを提案する.また、CRISPR Cas9 削除と小さい干渉の RNA を介したノックダウンによる O9 1 細胞の遺伝子の機能喪失の研究を実行するためのプロトコルを説明します。

Introduction

神経堤細胞 (Ncc) は、渡り鳥の驚くべき能力の萌芽期の開発の間に一時的な存在と多能性幹細胞です。Ncc は、表面の外胚葉と神経管の間発信や1萌芽期の開発の間に胚の他の部分への移行します。その機能領域に基づいて、いくつかの頭蓋を含む、さまざまな種類、トランク、迷走神経、仙骨の, と心臓 Ncc に Ncc を分類できます。さらに、Ncc は平滑筋細胞、骨細胞、神経細胞などの複数の細胞系統に分化し、様々 な組織2,3を生じさせるできます。Ncc の開発は、複雑な一連のさまざまな分子シグナルによって、微調整されてます形成イベントが特徴です。Ncc の複雑な規制と多数の構造への重要な貢献を与え、NCC 開発の破綻一般的に先天異常、すべてひと先天性先天性欠損症の約 30% を占めているにつながることができます。神経堤の開発中に異常口唇口蓋、欠陥につながることができます鼻形成、症候群、欠陥欠陥心臓流出路なども乳児死亡率1,4,5,6,7. NCC 開発の分子機構の解明は NCC 開発中の欠陥に起因する疾患の治療法開発のために重要です。様々 な生体外でそして生体内の使用に近づく8,9,10、11,12,13,14 ,15、かなり進展した NCC 研究。生体内で鶏、両生類、ゼブラフィッシュ、マウスなどの動物モデルは、Ncc1を調査する使用されています。さらに、早い人間の胚の開発16に NCC 移行の過程を研究する人間の胚が使用されています。生体外でセルのモデルながん患者の皮下脂肪に由来する人間の Ncc などパーキンソン病17を調査に使用されています。E8.5 マウス胚18から分離した内因性の Ncc の大衆文化から派生した当初、O9 1 NCC の行は勉強してながん。 重要なは、非分化培養条件下での強力な細胞モデル、O9 1 セル多能性幹のようながん。しかし、種類の識別細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、グリア細胞18などに、さまざまな文化状況で O9 1 セルを区別できます。これらのプロパティを指定すると、セル O9 1 使用されている広く頭蓋顔面欠損19,20の分子メカニズム解明などの NCC 関連の研究。

O9 の-1 細胞を維持し、異なったセルタイプに O9 1 細胞を分化、CRISPR Cas9 ゲノム編集と小さい干渉の RNA (siRNA) 遺伝子の機能喪失の研究を実行することによって O9 1 セルを操作するため詳細なプロトコルを提供するここでは、-ノックダウン技術を媒介します。代表的な例としてヤップおよびTazの機能喪失を研究する O9 1 セルの使用が説明されます。ヤップと Taz は、シグナル伝達経路は、細胞の増殖・分化・ アポトーシスの重要な役割を果たしているカバの下流のエフェクターです。カバの経路は、開発といくつかの異なる組織や臓器の恒常性だけでなくさまざまな病気20,21,22,23 の病因に重要であることも示されています。 ,24,25,26,,2728。カバがシグナル伝達のコア コンポーネントには、腫瘍サプレッサー滅菌 20 のようなキナーゼ Mst1/2、WW ドメイン含有サルバドール足場タンパク質、大きい腫瘍のサプレッサーの相同物 (Lats1/2) キナーゼが含まれます。カバ シグナリング ヤップおよび Taz の活性を阻害して、細胞質の劣化を促進します。カバから抑圧せずヤップおよび Taz が核に若しし、転写共活性化因子として機能します。最近示した具体的Wnt1creを使用してヤップおよび Taz のエフェクタ マウス Ncc をシグナリング カバを不活化して重度の E10.5 で胚致死の結果Wnt1Cre2SORドライバー顎顔面欠損20。ヤップと Ncc の Taz の役割を調べるため O9 1 細胞を用いた研究も行ってきました。NCC の増殖と分化、ヤップ・タズノックダウン ヤップおよび Taz 関数を勉強するセル O9 1 細胞で siRNA を使用して生成された、ヤップノックアウト細胞だった CRISPR Cas9 ゲノム編集を使用して生成されます。その他の経路の異なるターゲット遺伝子遺伝子の機能喪失と同じ戦略を適用できます。さらに、ゲインの機能研究とトランスフェクション アッセイも適用できます O9 1 細胞遺伝子の機能と制御の研究をします。ここで説明されているプロトコルは、O9 の-多能性幹細胞性を維持するために細胞を培養するため、異なる培養条件下での他の種類の細胞に分化 O9 1 細胞および遺伝子の機能を研究するために研究者によってガイドとして使用してNcc の分子機構。

Protocol

1. O9 1 細胞培養前に、の準備 注: O9 1 細胞培養で使用される基底のメディアする必要がありますエアコンされているによってサンドス近交系マウスの各/ウワバイン耐性 (STO) マウスの線維芽細胞の細胞;したがって、STO 細胞は, O9 1 細胞培養を開始する前に以下のように準備する必要があります。 アクティブな STO 細胞培養 7% ウシ胎児血清 (FBS) (?…

Representative Results

ノックダウンとノックアウト実験の目的は、ヤップおよびTazの機能喪失 O9 1 細胞の効果を研究することだった。ノックダウンとノックアウト実験前に我々 確かめなければならない基底メディアと文化 O9 の-1 セル (例では、図 1、および回復 O9 1 細胞のように、全体の板をカバーする基底膜マトリックス ニーズのため上記のように準…

Discussion

NCC は、さまざまな組織や臓器に汎用性と主要コントリビューターを胚形態形成中です。O9 の-1 セルの行は、その潜在的な多くの異なったセルタイプに区別するためを維持し、Ncc、遺伝子機能とながん分子制御を勉強するため生体外で役に立つツールの生体内特性を模倣します。O9 の-1 セルの別の状態は、異なる神経堤の子孫体内O9 1 細胞の培養条件によって対応がありま?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ニコール Stancel、博士号を取得、ELS、テキサス心臓研究所で科学的な出版物の編集サポートを提供しました。また次の資金源に感謝: アメリカの心臓協会のナショナル センターの科学者開発補助金 (j. 王に 14SDG19840000)、Rolanette、Berdon ローレンス ・骨疾患プログラムのテキサスから 2014 ローレンス研究賞 (j. 王に)、健康 (DE026561 ・ j ・ ワン、DE016320、r. Maxson に DE019650 に DE025873) の国立機関。

Materials

Active STO feeder cells ATCC ATCC CRL-1503 Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco 11960-044
DMEM, high glucose Hyclone SH30243.01
FBS (fetal bovine serum) Millipore Sigma ES-009-B
Penicillin – streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine 200mM (100X) Gibco 25030-081
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS Genesee Scientific 25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium Lonza 17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X Gibco 11140-050
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml Millipore Sigma ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Mitomycin C Roche 10107409001
Matrigel matrix Corning 356234
DMSO (dimethylsulfoxide) Millipore Sigma MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
Opti-MEM I (1X) Gibco 31985-070
Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine Corning 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA Dharmacon L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool Dharmacon D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA Dharmacon L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium )
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement
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Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (140), e58346, doi:10.3791/58346 (2018).
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