Cultivo y manipulación de células de la cresta Neural O9-1
Summary
O9-1 es una línea de células de cresta neural ratón pluripotentes. Aquí describimos protocolos detallados paso a paso para cultivar células O9-1, diferenciar células O9-1 hacia tipos celulares específicos y manipular genéticamente las células O9-1 mediante caída mediada por siRNA o CRISPR Cas9 edición del genoma.
Abstract
Las células de la cresta neural (NCCs) están migrando las células madre pluripotentes que pueden diferenciarse en diversos tipos celulares y dar lugar a múltiples tejidos y órganos. La línea celular O9-1 se deriva de la endógena NCCs embrionaria del ratón y mantiene su multipotencia. Sin embargo, bajo condiciones de cultivo específicas, O9-1 células pueden diferenciarse en diversos tipos celulares y ser utilizadas en una amplia gama de aplicaciones de investigación. Recientemente, con la combinación de estudios con ratones y estudios del O9-1 celular, hemos demostrado el hipopótamo señalización efectores vía Yap y Taz desempeñan papeles importantes en el desarrollo craneofacial derivado de cresta neural. Aunque el proceso de cultivo de células O9-1 es más complicado que para otras líneas celulares, la línea celular O9-1 es un potente modelo para la investigación de NCCs in vitro. Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de la línea celular de O9-1 para mantener su troncalidad, así como protocolos para diferenciar las células O9-1 en diferentes tipos celulares, como las células musculares lisas y los osteoblastos. Además, se describen los protocolos para realizar estudios de pérdida de función del gene en células O9-1 mediante eliminación de Cas9 CRISPR y caída de mediada por RNA interferente pequeños.
Introduction
Las células de la cresta neural (NCCs) son células madre multipotentes con una notable capacidad migratoria y existencia transitoria durante el desarrollo embrionario. NCCs se originan entre el ectodermo superficial y el tubo neural y migran a otras partes del embrión durante el desarrollo embrionario1. Basado en sus dominios funcionales, NCCs pueden clasificarse en varios tipos, incluyendo craneal, tronco, vagal, sacro y cardiaca NCCs. Además, la NCCs pueden diferenciarse en varios linajes celulares, como las células musculares lisas, células óseas y las neuronas y dan lugar a diferentes tejidos2,3. El desarrollo de la NCCs se caracteriza por una compleja serie de eventos morfogenéticos que son afinados por varias señales moleculares. Dada la compleja regulación de la NCCs y sus importantes contribuciones a numerosas estructuras, la desregulación del desarrollo del NCC comúnmente puede conducir a defectos congénitos de nacimiento, que representan casi el 30% de defectos de nacimiento congénitos humanos todos. Anormalidades durante el desarrollo de la cresta neural pueden provocar labio leporino/paladar hendido, defectos defectos de formación de la nariz, síndromes, como el tracto de salida cardíaco defectuoso o incluso mortalidad1,4,5, 6 , 7. comprender los mecanismos moleculares del desarrollo de la NCC es importante para el desarrollo de tratamientos para enfermedades causadas por defectos en el desarrollo de la NCC. Con el uso de varios in vitro e in vivo acerca a8,9,10,11,12,13,14 ,15, han realizado progresos considerables en la investigación de NCC. In vivo, modelos animales, como pollos, anfibios, peces cebra y ratones, se han utilizado para investigar la NCCs1. Además, los embriones humanos se han utilizado para estudiar el proceso de migración de NCC en el temprano desarrollo de embrión humano16. In vitro, modelos de celulares de la NCCs, como NCCs humana que se originaron en paciente grasa subcutánea, se han utilizado para investigar la enfermedad de Parkinson17. La línea O9-1 NCC, que fue derivada originalmente de cultivos masivos de NCCs endógena aislada de embriones de ratón E8.518, es un modelo de celular de gran alcance para estudiar la NCCs. lo importante es que, bajo condiciones de cultivo no diferenciar, O9-1 células NCCs como vástago multipotent. Sin embargo, bajo diferentes condiciones de cultivo, las células O9-1 se pueden distinguir en tipos distinguidos de la célula, como las células musculares lisas, osteoblastos, condrocitos y células gliales18. Dadas estas propiedades, las células O9-1 se han utilizado ampliamente para estudios relacionados con la NCC, como investigar el mecanismo molecular de defectos craneales facial19,20.
Aquí, protocolos detallados se proporcionan para mantener las células O9-1, diferenciando las células O9-1 en diferentes tipos celulares y manipular células O9-1 mediante la realización de estudios de pérdida de función del gene con la edición del genoma Cas9 CRISPR y ARN interferente pequeño (siRNA)- mediada por tecnologías de precipitación. Como un ejemplo representativo, se describe el uso de células O9-1 estudio de Yap y Taz -de-función de pérdida. Yap y Taz son los efectores corriente abajo del hipopótamo señalización camino, que juega un papel fundamental en la proliferación celular, diferenciación y apoptosis. La vía Hipona también se ha demostrado para ser importante en el desarrollo y la homeostasis de varios diferentes tejidos y órganos, así como en la patogénesis de diferentes enfermedades20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Los componentes básicos del hipopótamo de señalización incluyen el tumor supresor estéril 20-como las quinasas Mst1/2 WW que contiene el dominio Salvador proteína y las quinasas de homólogo (Lats1/2) de supresor de tumor grande. Señalización de hipopótamo inhibe la actividad de Yap y Taz y promueve su degradación en el citoplasma. Sin represión de Hippo, Yap Taz translocan en núcleos y funcionan como activadores transcripcionales de cooperación. Recientemente demostramos que inactivar específicamente el hipopótamo señalización efectores Yap y Taz en el ratón la NCCs utilizando Wnt1cre y controladores de Wnt1Cre2SOR dio lugar a mortalidad embrionaria en E10.5 con severa defectos craneofaciales20. También hemos realizado estudios usando células O9-1 para investigar el papel de Yap y Taz en la NCCs. Para estudiar la función Yap y Taz en la NCC proliferación y diferenciación, Yap y Taz caída células obtuvieron en O9-1 células utilizando siRNA, y células de nocaut de Yap se generaron utilizando CRISPR Cas9 edición del genoma. Las mismas estrategias de pérdida de función del gene se pueden aplicar a genes diferentes en otras vías. Además, estudios de ganancia de función y ensayos de transfección pueden aplicarse también a células O9-1 para estudiar la regulación y función génica. Los protocolos descritos aquí están destinados a ser utilizados por investigadores como guías para el cultivo de células de O9-1 para mantener la troncalidad multipotent, para diferenciar las células O9-1 en otros tipos de células bajo condiciones de cultivo diferentes y para estudiar la función genética y los mecanismos moleculares de la NCCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
El NCC es un versátil y clave a diferentes tejidos y órganos durante la morfogénesis embrionaria. La línea celular O9-1 mantiene su potencial para diferenciarse en muchos tipos de células diferentes y simula las características en vivo de la NCCs, convirtiéndolo en una herramienta útil en vitro para estudiar la función génica y regulación molecular de la NCCs. Del estado diferente de células O9-1 puede corresponder a diferentes nervios de la cresta progenie en vivo, dependiendo de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicaciones científicas en el Instituto del corazón de Texas, proporcionó apoyo editorial. También agradecemos a las siguientes fuentes de financiación: subvención de desarrollo de la American Heart Association nacional centro científico (14SDG19840000 a J. Wang), el Premio de investigación Lawrence de 2014 de la Rolanette y Berdona Lawrence hueso enfermedad programa de Texas (a J. Wang ) y los institutos nacionales de salud (DE026561 y DE025873 J. Wang, DE016320 y DE019650 a R. Maxson).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
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