경작 및 O9-1 신경 크레스트 세포의 조작

Summary

O9-1 multipotent 마우스 신경 크레스트 셀 라인입니다. 여기는 O9-1 세포를 배양, O9-1 세포 특정 세포 유형으로 분화 하 고 유전자 O9-1 셀 siRNA 중재 최저 또는 CRISPR Cas9 게놈 편집을 사용 하 여에 대 한 자세한 단계별 프로토콜에 설명 합니다.

Abstract

신경 크레스트 셀 (NCCs) multipotent 줄기 세포를 다른 세포 유형으로 분화 하 고 여러 조직 및 장기를 야기할 수 있는 마이그레이션 됩니다. O9-1 셀 라인은 내 생에서 파생 된 배아 NCCs 마우스 및 그 multipotency 유지. 그러나, 특정 문화 조건 O9-1 셀 다른 세포 유형으로 분화 할 수 있다 하 고 연구 응용 프로그램의 넓은 범위에서. 최근, 마우스 연구 및 O9-1 셀 연구의 조합, 우리가 나타났습니다 그 Taz 및 Yap 신경 크레스트 파생 craniofacial 개발에 중요 한 역할을 재생할 통로 이펙터를 신호 하는 마. O9-1 셀에 대 한 자란 과정은 더 복잡 한 다른 셀 라인에 사용 하는 것, 비록 O9-1 셀 라인 NCCs 체 외조사에 대 한 강력한 모델입니다. 여기, 선물이 경작 O9-1 셀 라인의 stemness, 뿐만 아니라 프로토콜 O9-1 세포, 평활 근 세포와 osteoblasts 다른 세포 유형으로 차별화를 유지 하기 위한 프로토콜. 또한, 프로토콜 O9-1 셀에 CRISPR Cas9 삭제 및 작은 간섭 RNA 중재 최저 사용 하 여 유전자 손실의 기능 연구를 수행 하는 데 설명 합니다.

Introduction

신경 크레스트 셀 (NCCs) 놀라운 철새 능력 및 배아 개발 하는 동안 일시적인 존재 multipotent 줄기 모양의 세포 이다. NCCs 표면 ectoderm 신경 관 사이 시작 하며 배아 개발¹동안 태아의 다른 부분에 이주. 도메인의 기능에 따라, NCCs 여러 종류, 두개골 등, 트렁크, vagal, 성 례, 그리고 심장 NCCs로 분류할 수 있습니다. 또한, NCCs 여러 세포 계보, 부드러운 근육 세포, 뼈 세포, 신경, 등으로 구분 하 고 다양 한 조직^2,3을 야기할 수 있습니다. NCCs의 개발은 끈 다양 한 분자 신호 하 여 전체적 사건의 복잡 한 시리즈에 의해 특징입니다. NCCs의 복잡 한 규제 및 수많은 구조에 그들의 중요 한 기여를 감안할 때, NCC 개발의 dysregulation 이어질 수 있습니다 일반적으로 선 천 성 기형, 모든 인간의 선천적인 출생 결함의 약 30%를 위한 계정. 신경 크레스트 개발 하는 동안 이상 갈라진된 입술 또는 구개, 결함이 발생할 수 있습니다 코 형성, 증후군, 결함 결함 심장 유출 관, 또는 심지어 유아 사망률^{1,,45, 6 , 7}. NCC 개발의 분자 메커니즘을 이해 하는 것이 NCC 개발에 결함으로 인 한 질병에 대 한 치료법 개발을 위한 중요. 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 의 사용과 접근^{8,,910,11,12,13,14 ,15}를 상당한 진전이 NCC 연구에서. Vivo에서, 닭, 등 양서류, zebrafish, 마우스, 동물 모델 NCCs¹을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 인간의 배아 초기 인간 배아 개발¹⁶NCC 마이그레이션 과정을 공부 하 사용 되었습니다. 생체 외에서셀 모델에서 NCCs 환자 피하 지방에서 시작 된 인간의 NCCs 등에 대 한 파 킨 슨 병¹⁷조사에 사용 되었습니다. O9-1 NCC 선, 원래 생 NCCs E8.5 마우스 배아¹⁸에서 고립의 대량 문화에서 파생 된, 공부 NCCs. 중요 한 것은, 비 차별 문화 조건에 대 한 강력한 셀 모델, O9-1 세포는 multipotent 줄기 같은 NCCs. 그러나, 다양 한 문화 조건에서 O9-1 셀 평활 근 세포, osteoblasts, chondrocytes, glial 세포¹⁸등 고유 세포 유형으로 분화 될 수 있다. 이러한 속성을 감안할 때, O9-1 셀 NCC 관련 연구, 두개골 얼굴 결함^19,20의 분자 메커니즘을 조사 하는 등 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다.

여기, 상세한 프로토콜 제공 O9-1 세포를 유지, O9-1 세포를 다른 세포 유형으로 차별화 하 고 O9-1 세포 게놈 편집과 작은 간섭 RNA (siRNA)을 CRISPR Cas9 유전자 손실의 기능 연구를 수행 하 여- 최저의 기술 중재. 대표적인 예로 야프 와 Taz 손실-의-기능을 공부 O9-1 셀의 사용을 설명 합니다. 야프와 Taz는 신호 전달 경로, 세포 증식, 감 별 법 및 apoptosis에 중요 한 역할을 담당 하는 마의 다운스트림 이펙터. 뚱 땡 통로 또한 보였다 개발 및 여러 다른 조직 및 장기의 항상성 뿐만 아니라 다른 질병^{20,,2122,23의 병 인에 중요 한 것 ,,2425,26,,2728}. Hippo 신호의 핵심 구성 요소는 종양 억제기 살 균 20 같은 kinases Mst1/2, WW 도메인 포함 된 살바도르 비 계 단백질, 및 큰 종양 억제기 상 동 기관 (Lats1/2) kinases 포함 됩니다. Hippo 신호 Taz 및 Yap 활동을 억제 하 고 세포질에 그들의 저하를 촉진 합니다. 하 마에서 억압 하지 않고 얍 Taz 수 핵으로 이동 및 공동 transcriptional 활성 제 기능. 우리 최근 특히^cre Wnt1사용 하 여 마우스 NCCs Taz 및 Yap 이펙터를 신호 하는 마를 비활성화 하 고 심한와 E10.5에서 배아 치 귀착되 었 다 Wnt1^Cre2SOR 드라이버 craniofacial 결함²⁰. 우리는 또한 야프 NCCs에 Taz의 역할을 조사 하기 위해 O9-1 셀을 사용 하 여 연구를 수행 했습니다. NCC 확산 및 감 별 법, 야프 Taz 최저 Taz 및 Yap 함수를 공부 하려면 세포 siRNA를 사용 하 여 O9-1 셀에 생성 했다 고 얍 녹아웃 셀 CRISPR Cas9 게놈 편집 사용 하 여 생성 된. 다른 경로에 다른 대상 유전자 동일한 유전자 기능 손실 전략을 적용할 수 있습니다. 또한, 이득의 기능 연구와 transfection 분석 또한 적용할 수 있습니다 유전자 기능과 규제 연구 O9-1 셀에. 여기에 설명 된 프로토콜 multipotent stemness 유지 O9-1 세포를 배양, O9-1 셀 조건 하에서 다른 문화, 다른 세포 유형으로 차별화 및 유전자 기능을 공부 가이드로 조사자에 의해 사용 될 것입니다 및 NCCs의 분자 메커니즘입니다.

Protocol

1. O9-1 세포 배양 전에 준비 참고: 기저 미디어 O9-1 세포 배양에 사용 해야 합니다 단련 되어 근 친 Sandos 쥐 thioguanine/ouabain 방지 (STO) 마우스 fibroblast 세포; 따라서, STO 셀 얻은 O9-1 세포 배양을 시작 하기 전에 다음과 같은 준비를 해야 합니다. 활성 STO 세포 배양 7% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) (미 발달 줄기 세포 문화 등급), 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스와 …

Representative Results

우리의 최저 및 녹아웃 실험의 목표 Taz 및 Yap 손실-의-기능 O9-1 셀에의 효과 연구 했다. 최저의 및 녹아웃 실험 하기 전에 우리는 되도록 기저 미디어와 문화 O9-1 셀 (예: 그림 1및 복구 O9-1 셀에 표시 된 전체 접시를 충당 하기 위해 지하실 멤브레인 매트릭스 요구 위에서 설명한 대로 준비 하는 액체 질소 그림 2에서 …

Discussion

NCC 배아 morphogenesis 동안 다른 조직 및 장기에 다양 하 고 핵심 기여자 이다. O9-1 셀 라인 많은 다른 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력을 유지 하 고 모방 NCCs, 유전자 기능을 연구 하 고 NCCs 분자 규제에 대 한 유용한 체 외에 도구를 만드는의 비보에 특성. O9-1 세포의 다른 상태는 다른 신경 크레스트 자손에서 vivo에서, O9-1 셀의 문화 조건에 따라에 해당할 수 있습니다. O9-1 셀 mult…

Materials

Active STO feeder cells	ATCC	ATCC CRL-1503	Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line	Millipore Sigma	SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine	Gibco	11960-044
DMEM, high glucose	Hyclone	SH30243.01
FBS (fetal bovine serum)	Millipore Sigma	ES-009-B
Penicillin – streptomycin	Gibco	15140-122
L-glutamine 200mM (100X)	Gibco	25030-081
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS	Genesee Scientific	25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium	Lonza	17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X	Gibco	11140-050
Sodium pyruvate (100mM)	Gibco	11360-070
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml	Millipore Sigma	ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)	R&D Systems	233-FB-025
Mitomycin C	Roche	10107409001
Matrigel matrix	Corning	356234
DMSO (dimethylsulfoxide)	Millipore Sigma	MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778-075
Opti-MEM I (1X)	Gibco	31985-070
Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine	Corning	10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA	Dharmacon	L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool	Dharmacon	D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA	Dharmacon	L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium )
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement