Культивирование и манипуляции O9-1 Нейронные крест клеток
Summary
O9-1 — линия клеток нейронные крест Multipotent с мышью. Здесь мы описываем подробные пошаговые протоколы для культивирования клеток O9-1, дифференциации клеток O9-1 в типы конкретных клеток и генетически манипулировать O9-1 клетки с помощью малых интерферирующих РНК опосредованной нокдаун или изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9.
Abstract
Гребень нервной клетки (СЧД) переносятся Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в различных типов клеток и порождают множественные тканей и органов. O9-1 клеточная линия является производным от эндогенных мыши эмбриональные СЧД и поддерживает его multipotency. Однако в условиях конкретной культуры, O9-1 клетки могут дифференцироваться в различных типов клеток и использоваться в широком диапазоне исследований приложений. Недавно с сочетанием мыши и исследований клеток O9-1, мы показали, что бегемот, сигнальные пути эффекторов яп и таз играют важную роль в нейронные крест производные краниофациальных развития. Хотя процесс культивирования клеток O9-1 является более сложной, чем для других клеточных линий, O9-1 клеточная линия представляет собой мощный модель для изучения СЧД в пробирке. Здесь мы представляем собой протокол для культивирования клеток линии O9-1 для поддержания его stemness, а также протоколы для дифференциации клеток O9-1 в различных типов клеток, таких как гладких мышечных клеток и остеобластов. Кроме того описываются протоколы для выполнения исследования потери функции генов в клетках O9-1 с помощью удаления ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и малые интерферирующие РНК опосредованной нокдаун.
Introduction
Гребень нервной клетки (СЧД) являются Multipotent с экстрактами стволовых как клетки с замечательным миграционной способности и переходных существование во время эмбрионального развития. СЧД происходят между поверхности эктодермы и нервной трубки и мигрировать в другие районы эмбриона во время эмбрионального развития1. Основываясь на их функциональные домены, СЧД можно разделить на несколько различных типов, в том числе черепа, ствол, вагусной, сакральный и сердца СЧД. Кроме того СЧД могут дифференцироваться в несколько линий клеток, например, гладкомышечные клетки, костные клетки и нейроны и привести к возникновению различных тканей2,3. Развитие СЧД характеризуется сложной серии морфогенетических событий, которые настроены на различных молекулярных сигналов. Учитывая сложные регулирование СЧД и их важный вклад в многочисленные структуры, регуляции NCC развития часто может привести к врожденных врожденных дефектов, которые составляют около 30% всех человеческих врожденных врожденных дефектов. Аномалии в ходе разработки нейронные крест может привести к заячья губа/неба, недостатки формирования носа, синдромы, дефекты например дефектных сердца отток тракта, или даже младенческой смертности1,4,5, 6 , 7. понимание молекулярных механизмов развития НСС имеет важное значение для разработки методов лечения заболеваний, вызванных дефектами в развитии НКК. С использованием различных in vitro и in vivo подходы8,9,10,11,12,13,14 ,15, был достигнут значительный прогресс в исследованиях НКК. В естественных условиях, животных моделей, в том числе кур, земноводных, данио рерио и мышей, использовались для изучения СЧД1. Кроме того человеческие эмбрионы были использованы для изучения процесса миграции НКК в начале развития эмбриона человека16. В пробирке, ячейки модели для СЧД, таких как человека СЧД, которые возникли от пациента подкожной жировой клетчатки, использовались для изучения болезни Паркинсона17. NCC O9-1 линия, которая была первоначально производным от массовой культуры эндогенного СЧД, изолированных от зародышей мыши E8.518, является мощным ячеечная модель для изучения СЧД. Важно отметить, что в условиях культуры-дифференцируя, клетки O9-1 Multipotent с экстрактами стволовых как СЧД. Однако в условиях разной культуры O9-1 клетки могут быть продифференцированы в типы уважаемого клеток, таких как гладкомышечные клетки, остеобласты, хондроцитов и глиальных клеток18. Учитывая эти свойства, клетки O9-1 широко использовались для исследований, касающихся NCC, например расследование молекулярный механизм черепно лицевых дефектов19,20.
Здесь предоставляются подробные протоколы для поддержания клеток O9-1, дифференцируя O9-1 клеток в различных типов клеток и манипулирования O9-1 клетки, выполняя исследования потери функции гена с ТРИФОСФАТЫ-Cas9 изменения генома и малые интерферирующие РНК (siRNA)- при посредничестве нокдаун технологий. В качестве примера представитель описано использование клеток O9-1 для изучения яп и таз -из функция потерь. Вниз по течению эффекторов Бегемот, сигнальный путь, который играет важную роль в клеточной пролиферации, дифференциация и апоптоз YAP и таз. Бегемот путь также было показано важное значение в развитии и гомеостаза нескольких различных тканей и органов, а также в патогенезе различных заболеваний20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Основные компоненты Бегемот сигнализации включают опухоли подавитель стерильные 20-как киназы Mst1/2, WW домена содержащих Сальвадор эшафот белков и большие опухолевые супрессоры гомолога (Lats1/2) киназы. Бегемот сигнализации препятствует яп и таз активности и способствует их деградации в цитоплазме. Без репрессий бегемота яп и таз можно перемещать в ядрах и функционировать как транскрипционный анализ совместного активаторы. Мы недавно показали, что конкретно инактивации Бегемот сигнализации эффекторов яп и таз в мыши СЧД, используя Wnt1КРР и Wnt1Cre2SOR водителей привело к эмбриональной летальность в E10.5 с тяжелыми краниофациальных дефектов20. Мы также выполняются исследования с использованием клеток O9-1 для изучения роли Yap и таз в СЧД. Для изучения функции Yap и таз в НКК распространения и дифференциации, яп и таз нокдаун клетки были созданы в клетках O9-1 с помощью малых интерферирующих РНК, и яп нокаут клетки были созданы с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9. Те же стратегии потери функции гена могут применяться для различных целевых генов в другие пути. Кроме того получить из функция исследования и анализы transfection может применяться также к клеткам O9-1 для изучения функции гена и регулирования. Протоколы, описанные здесь, предназначены для использования следователями в качестве руководства для культивирования клеток O9-1 для поддержания Multipotent с stemness, для дифференциации клеток O9-1 в другие типы клеток в условиях разных культур и для изучения функции гена и молекулярные механизмы СЧД.
Protocol
Representative Results
Discussion
НКК является универсальным и ключевой вклад различных тканей и органов во время эмбрионального морфогенеза. O9-1 клеточная линия ведет свой потенциал, чтобы дифференцироваться в много различных типов клеток и имитирует в vivo характеристики СЧД, что делает его полезным в vitro инс?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Николь ШТАНСЕЛЬ, Ph.D., ELS, научных публикаций в институте сердца Texas, условии редакционной поддержки. Мы также благодарим следующие источники финансирования: Американской ассоциации сердца Национальный центр ученый развития Грант (14SDG19840000 J. Wang), 2014 Лоуренс исследования награда от Rolanette и Berdon Лоуренс кости болезни программа Техас (J. Wang ) и национальных институтов здравоохранения (DE026561 и DE025873 J. Wang, DE016320 и DE019650 на р. Maxson).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
References
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
- Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
- Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
- Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
- Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
- Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
- Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
- Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
- Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
- Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
- Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
- Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
- Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
- Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
- Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
- Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
- Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
- Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
- Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
- Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
- Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
- Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).
