Denne protokol beskriver fjernelse og rensning af lungepulsåren endothelial celler (PAECs), overholde hjælpebobler af Swan-Ganz katetre, mens de er klemt inde i lungepulsåren under højre hjerte kateterisation og forblive vedhængende til den deflateret ballon efter fjernelse fra patientens krop.
En række forskellige patologier føre til pulmonal hypertension (PH), der defineres som en gennemsnitlig lungepulsåren tryk, der overstiger 25 mmHg i hvile. Yderligere diagnosticere og administrerer PH, gennemgå patienter gentagne højre hjerte catheterizations (RHC) hvori en Swan-Ganz kateter er avanceret til en gren af lungepulsåren og en ballonen er oppustet for at kile kateter tip. Denne artikel illustrerer en protokol, hvorved lungepulsåren endothelial celler (PAECs) kan være høstet fra ballon tips af Swan-Ganz katetre efter RHC og renset med en anti-CD146 affinitet kolonne teknik til at rense formodede PAECs. Disse celler kan bruges til at give en in situ øjebliksbillede af pulmonal Vaskulaturen endotelet at supplere hæmodynamiske målinger opnået under RHC biologiske tilstand. Høstet og renset PAECs kan bruges til enten cellekultur eller efterfølgende analytiske assays såsom flow cytometery.
Nuværende amerikanske og europæiske retningslinjer kræver højre hjerte kateterisation til diagnosticering af pulmonal hypertension1. Ønske om biologiske prøver fra pulmonal Vaskulaturen som supplement til de hæmodynamiske data, der indsamles under RHC, læger og forskere søger at forstå denne sygdom. Desværre risikoen forbundet med pulmonal vaskulær biopsi er meget høj, og derfor biologiske prøver af pulmonal Vaskulaturen er sjældent, hvis nogensinde opnået fra levende patienter, som gennemgår RHC. Mens megen indsigt har opnået fra pulmonal karvæv fremstillet af dødt eller eksplanterede lunger, disse prøver er i stand til at afspejle biologi af PH sygdomsproces, som det udspiller sig i en levende patient. I 2013 rapporteret vi først at lungepulsåren endothelial celler (PAECs) er undveg fra grene af lungepulsåren ved fysisk kontakt med ballon aflæsse af Swan-Ganz kateteret under RHC og kan inddrives i små numre fra kateteret tips efter procedure2.
Denne artikel illustrerer vores teknik til fjernelse og rensning af lungepulsåren endothelial celler (PAECs) fra ballon tips af Swan-Ganz katetre efter højre hjerte kateterisation. Hidtil, er metoden for at udføre denne høst teknik blevet beskrevet tilstrækkeligt detaljeret i litteraturen til at sikre ensartede resultater mellem laboratorier udfører teknikken. Denne artikel er bestemt til at overvinde denne mangel, tilbyder visualiseret demonstration af teknikken, fra sengelamper samling af kateter tips til det endelige produkt af renset CD146 + endotelceller. Denne teknik bør støtte i at fremme forskning i pathobiology af forskellige etiologies af PH og muligvis resultere i udviklingen af nye diagnostiske assays til at supplere hæmodynamiske data indsamlet under RHC.
Betydningen af denne teknik til feltet af pulmonal vaskulær medicin og forskning er at det giver adgang til et øjebliksbillede af biologi af pulmonal endotelet i situ og i modsætning til tidligere undersøgelser om eksplanterede eller dødt lunger, repræsenterer ikke et slutpunkt for fagets lunge. For nylig, har vi vist, at en anti-apoptotiske biomarkør i disse celler kan have nytte i mere præcist fænotyper relateret sorter af pulmonal hypertension3. Udbyttet af celler fremstillet er relativt lille, ~ 5, 000-25.000 PAECs pr. sample, og disse celler er svært (men ikke umuligt) at kultur. Vi mener, at kloge klinikere og forskere vil finde synergier mellem disse følgesvend teknikker for at fremme pulmonal vaskulær forskning, diagnosticering og prognoser.
Den teknik, der er beskrevet i denne artikel er bedst værdsat i forbindelse med tidligere eksperimentelle paradigmer for at studere den pulmonal vaskulær endotel. Tidligere forsøg på at hente PAECs fra mennesker har været begrænset til eksplanterede/dødt lungerne5 og en kortlivet forsøg på at udvikle et kateter i stand til at lungepulsåren biopsi6. Som bemærket i en nylig revision7, kan den nuværende teknik skelnes fra lunge væv høst ved sin evne til at indhente PAECs fra en levende menneskelige og gøre det på flere tidspunkter i progression af sygdom og/eller terapi. Dog skal det bemærkes, at en følgesvend teknik er for nylig blevet rapporteret hvorved induceret pluripotente stamceller (IPSCs) kan være transdifferentiated til PAECs4,5. Denne teknik giver rigelige kulturer af patient-specifikke PAECs og giver mulighed for undersøgelse af virkningerne af patient-specifikke genetiske baggrund på PAEC biologi. På trods af disse fordele, kan ikke disse IPSC-afledte PAECs tilbyde nogen oplysninger om samspillet mellem lokale mikromiljø og patient-specifikke genetiske baggrund. Vores gruppe har fremlagt den opfattelse, at “cath tip” og IPSC teknikker er tilbøjelige til at være synergistisk fremme felt8.
I denne nuværende og historiske kontekst, skal begrænsninger af denne teknik bemærkes. For det første er det vigtigt at bemærke, at udbyttet af PAECs stammer fra denne metode kan variere betydeligt. Formentlig, patient-, sygdom stat – og læge-specifikke faktorer bidrager til denne variabilitet, da protokollen ikke indeholder trin, der forventes at medføre store tab af kildematerialet. Tabel 1 viser repræsentant CD146 + udbytter fra en lang række PAEC høst udnytte kateter tips fra en bred vifte af patienter med forskellige sygdomstilstande af pulmonal hypertension og en bred vifte af læge operatører. For det andet celle udbytter er generelt lav, og deres levedygtighed for kultur har vist sig for at være lavere endnu i vores hænder. Mens vi har tidligere dyrket kulturer af PAECs ved hjælp af denne metode1, vi går ud fra disse resultater udgør redning af en delmængde af stamceller efter die-off af de fleste af prøven og er kun sporadisk succes i vores hænder. For eksempel er det ikke usædvanligt at finde kun et par dusin tilhænger PAECs i kultur om morgenen efter en høst har været forgyldt. Ofte overlever disse mikro-kulturer ikke til ekspansion. Yderligere indsats er nødvendig for at optimere denne protokol på en måde, der vil opretholde PAECs levedygtighed og deres betingelser i kultur til at nå de ønskede mål for spredning af patient-specifikke PAEC høsten. Endelig, den CD146 positive valg har vi tilpasset ikke udelukke kontaminering med andre CD146 + celler, såsom cirkulerende endotelceller4, pericytes, glatte muskelceller og sjældne CD146 + T celler9,10. Alligevel, disse celler antages at være meget få i antal i prøver, der opsamlet på denne måde, og CD146 er betydeligt mere specifikt for denne protokol end andre celle markører i endothelial celler såsom CD31 (der er også til stede på en bred vifte af blodbårne celler herunder blodplader11). Eventuelle fremtidige forbedringer med henblik på at forbedre specificitet bør afvejes mod deres potentielt negativ effekt på udbyttet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke læger og støtte personalet i tjenesten avanceret hjerteinsufficiens og Pulmonal Hypertension Allegheny General Hospital til bestemmelse af hundredvis af kateter prøver over flere år, som har fremmet den optimering af denne metode.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |