Noninvasive controle van de grootte van de laesie in een heteroloog muismodel van endometriose

Summary

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging van fluorescently geëtiketteerde menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten geënt in muizen. De methode kunt bestuderen van de gevolgen van de drugs van keuze voor endometriotic laesie grootte door middel van controle en kwantificering van de fluorescentie die wordt uitgestoten door de fluorescerende verslaggever op real-time

Abstract

Hier beschrijven we een protocol voor de uitvoering van een heteroloog muismodel waarin progressie van endometriose kan worden beoordeeld in real time via noninvasive monitoring van fluorescentie uitgestoten door geïmplanteerde ectopische menselijke baarmoederslijmvlies weefsel. Voor dit doel worden Biopten van menselijke endometrium donor vrouwen lopende oöcyt donatie verkregen. Menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten worden gekweekt in aanwezigheid van adenovirussen ontworpen om uitdrukkelijke cDNA voor de verslaggever fluorescent proteïne mCherry. Label op visualization, weefsels met een optimale tarief van fluorescentie na infectie worden vervolgens gekozen voor de implantatie in ontvangende muizen. Een week voorafgaand aan de implantatie-operatie, ontvangende muizen zijn oophorectomized en estradiol pellets subcutaan worden geplaatst om de overleving en de groei van de laesies. Op de dag van de operatie zijn muizen narcose en peritoneale holte benaderd via een kleine (1,5 cm) incisie door de linea-alba. Fluorescently geëtiketteerde implantaten zijn tweezed, kort gedrenkt in lijm en gekoppeld aan de peritoneale laag. Insnijdingen zijn ingehecht en dieren verlaten om te herstellen voor een paar dagen. Fluorescentie uitgestoten door endometriotic implantaten is meestal niet-gebeurt elke 3 dagen voor 4 weken met een in vivo imaging systeem gecontroleerd. Variaties in de grootte van endometriotic implantaten kunnen worden geraamd in real-time door de kwantificering van de mCherry signaal en de normalisatie tegen het oorspronkelijke tijd-punt maximale fluorescentie intensiteit tonen.

Traditionele preklinische knaagdieren van modellen van endometriose staan geen niet-invasieve monitoring van de laesie in real-time maar eerder toe evaluatie van de effecten van drugs vehiculumcontrolegroep op het eindpunt. Dit protocol maakt het mogelijk om bij te houden van de laesies in real-time en meer nuttig kunnen de therapeutische mogelijkheden van drugs in preklinische modellen van endometriose. De belangrijkste beperking van de aldus opgewekte model is dat niet-invasieve toezicht niet mogelijk gedurende lange perioden van tijd als gevolg van de episomal uitdrukking van Ad-virus is.

Introduction

Endometriose is een chronische gynecologic disorder, geïnitieerd door de inplanting van het functionele baarmoederslijmvlies buiten de baarmoederholte. Ectopische laesies groeien en veroorzaken van inflammatoire processen die leiden tot chronische bekken pijn en onvruchtbaarheid¹. Geschat wordt dat omhoog tot 10 – 15% van de vrouwen in de reproductieve leeftijd worden beïnvloed door endometriosis2, en het is aanwezig in ongeveer 40-50% van onvruchtbare vrouwen³. Huidige farmacologische behandelingen voor endometriose zijn niet in staat om volledig uit te roeien laesies en niet vrij van bijwerkingen^4,5. Het onderzoek voor meer efficiënte therapieën vereist van de verfijning van de bestaande diermodellen van endometriose op zodanige wijze dat menselijke laesies op de juiste wijze kunnen worden geïmiteerd, en de effecten van verbindingen op de grootte van de laesie o.a. nauw kunnen worden beoordeeld.

Primate modellen zijn gebruikt om na te bootsen endometriose door het inplanteren van ectopische laesies histologisch identiek en op vergelijkbare sites zoals mensen^6,7,8; echter, ethische bezwaren en de hoge economische kosten in verband met experimenten met primaten limiet hun gebruik⁹. Bijgevolg blijft het gebruik van kleine dieren, vooral knaagdieren, voor de uitvoering van in vivo modellen van endometriose worden begunstigd omdat het zorgt studies met grotere aantallen personen^10,11. Endometriose kan in deze dieren worden opgewekt door het transplanteren van stukken van knaagdier baarmoeder horens (“homologe modellen”)^12,13 of menselijk baarmoederslijmvlies/endometriotic weefsel naar ectopische sites (heterologe modellen)¹⁴ . In tegenstelling tot mensen, knaagdieren doen hun baarmoederslijmvlies weefsel niet vergoten en daardoor endometriose kan niet worden ontwikkeld spontaan in deze soorten. Homologe muis modellen van endometriose hebben bekritiseerd vanwege het feit dat ectopische muis uteriene weefsel ingeplant weerspiegelen derhalve niet de kenmerken van menselijke endometriotic laesies¹⁵.

Passende fysiologie van endometriose kan worden geïmiteerd in de heterologe modellen van endometriose waar verse menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten immunodeficiëntie dieren zijn ingeplant. Conventionele heterologe modellen, worden de therapeutische effecten van verbindingen van belang vaak beoordeeld op het eindpunt van de beoordeling van de grootte van de laesie met het gebruik van de remklauwen¹⁶. Een duidelijke beperking is dat, als zodanig, eindpunt diermodellen niet toestaan studeren implantatie dynamics of endometriotic laesie ontwikkeling na verloop van tijd. Een extra beperking is dat het gebruik van de remklauwen niet nauwkeurige metingen van de grootte van de laesie toelaat. Inderdaad, de standaardfout geboden door remklauwen is in hetzelfde bereik (dat wil zeggen, millimeters) als de omvang van de letsels geïmplanteerd in muizen, dus de beperking van de capaciteit van deze hulpprogramma’s te detecteren van werkelijke variaties in grootte.

Om deze beperkingen te overwinnen, hierin beschrijven we de generatie van een heteroloog muismodel van endometriose waarin geïmplanteerde menselijk weefsel is ontworpen om uit te drukken een verslaggever m-Cherry fluorescent proteïne. Detectie van het fluorescerende signaal met een passende afbeelding-systeem maakt het mogelijk niet-invasieve monitoring van de status van de laesie met gelijktijdige kwantificering van het formaat in real-time. Ons model biedt dus duidelijke voordelen in vergelijking met conventionele eindpunt modellen, aangezien het de mogelijkheid van bewaking in real-time niet-invasieve en de mogelijkheid voor het uitvoeren van meer objectieve en nauwkeurige schatting van de variaties in de grootte van de laesie brengt.

Protocol

Het gebruik van menselijk weefsel specimens is goedgekeurd door de institutionele Review Board en de ethische commissie van het Hospital Universitario La Fe. Alle patiënten verstrekte schriftelijke geïnformeerde toestemming. De studie waarbij dieren werd goedgekeurd door de Commissie van de institutionele dier zorg bij het Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, en alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van zoogdieren van de nationale instituten van de ge…

Representative Results

Hier beschrijven we het proces voor het maken van een heteroloog model van endometriose waarin de architectuur van letsels wordt bewaard door het implanteren van fluorescently geëtiketteerde stukken van menselijke endometrium in immuungecompromitteerde muizen, waardoor niet-invasieve controle van de laesie progressie. Etikettering van baarmoederslijmvlies fragmenten wordt bereikt door besmetting met adenovirus ontworpen om uitdrukkelijke mCherry, een eiwit uitstoten fluorescentie in het …

Discussion

Het protocol hierin gedetailleerde beschrijving van de implementatie van een dierlijk model van endometriose waarin de architectuur van het implanteren van laesies het platform is bewaard terwijl tegelijkertijd waardoor real-time beoordeling van de fluorescentie uitgestoten door mCherry Label baarmoederslijmvlies weefsel. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een specifieke in vivo imaging systeem en verwante software te beoordelen niet-gebeurt fluorescentie uitgestoten door de gelabelde laesie. Elke gebruiker m…

Materials

Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	—	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1000 mg/g	B-BRAUN	—	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	—	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	—	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	—	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	—	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	—	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator