endometriosis के एक विषमजात माउस मॉडल में घाव आकार की noninvasive निगरानी
Summary
यहां, हम प्रतिदीप्ति के लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत मानव एंडोमेट्रियल टुकड़े चूहों में इसराईल लेबल । विधि की निगरानी और वास्तविक समय पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के परिमाणन के माध्यम से एंडोमेट्रियल घाव के आकार पर पसंद की दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है
Abstract
यहां, हम एक heterologous माउस मॉडल के कार्यांवयन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन जिसमें endometriosis की प्रगति प्रत्यारोपित अस्थानिक मानव एंडोमेट्रियल ऊतक द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की noninvasive निगरानी के माध्यम से वास्तविक समय में मूल्यांकन किया जा सकता है । इस प्रयोजन के लिए, मानव एंडोमेट्रियम की बायोप्सी दाता महिलाओं चल रही अंडक दान से प्राप्त कर रहे हैं । मानव एंडोमेट्रियल टुकड़े एडिनोवायरस रिपोर्टर फ्लोरोसेंट प्रोटीन mcherry के लिए cdna एक्सप्रेस के लिए इंजीनियर की उपस्थिति में सुसंस्कृत हैं । दृश्य पर, संक्रमण के बाद प्रतिदीप्ति की इष्टतम दर के साथ लेबल वाले ऊतकों को बाद में प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपण के लिए चुना जाता है । एक सप्ताह के प्रत्यारोपण सर्जरी से पहले, प्राप्तकर्ता चूहों oophorectomized हैं, और एस्ट्राडियोल छर्रों के अस्तित्व और घावों के विकास को बनाए रखने के लिए subcutaneously रखा जाता है । सर्जरी के दिन चूहों एनेस्थेटाइज्ड हैं, और पेरिटोनियल गुहा linea-अल्बा द्वारा एक छोटे (१.५ सेमी) चीरा के माध्यम से पहुँचा. प्रतिदीप्ति लेबल प्रत्यारोपण tweezed हैं, संक्षेप में गोंद और पेरिटोनियल परत से जुड़ी लथपथ । चीरों sutured कर रहे हैं, और जानवरों के कुछ दिनों के लिए ठीक करने के लिए छोड़ दिया है । एंडोमेरिओटिक प्रत्यारोपण द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति आमतौर पर वीवो इमेजिंग सिस्टम के साथ 4 सप्ताह के लिए हर 3 दिनों में गैर-आक्रामक रूप से निगरानी की जाती है । एंडोमेट्रियल प्रत्यारोपण के आकार में भिन्नता mcherry संकेत के परिमाणन और प्रारंभिक समय-बिंदु अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखा के खिलाफ सामान्यीकरण द्वारा वास्तविक समय में अनुमान लगाया जा सकता है ।
endometriosis के मॉडल के पारंपरिक पूर्व नैदानिक कुतर वास्तविक समय में घाव की गैर आक्रामक निगरानी की अनुमति नहीं है बल्कि अंत बिंदु पर बीएसए दवाओं के प्रभाव के मूल्यांकन की अनुमति नहीं है । इस प्रोटोकॉल एक वास्तविक समय में घावों को ट्रैक करने के लिए अनुमति देता है और endometriosis के पूर्व नैदानिक मॉडल में दवाओं की चिकित्सीय क्षमता का पता लगाने के लिए और अधिक उपयोगी है । इस प्रकार उत्पन्न मॉडल की मुख्य सीमा यह है कि गैर-इनवेसिव मॉनिटरिंग विज्ञापन-वायरस के एपिसोमल अभिव्यक्ति के कारण समय की लंबी अवधि से संभव नहीं है ।
Introduction
एंडोमेट्रोसिस एक पुरानी स्त्रीरोगों विकार है जो गर्भाशय गुहा के बाहर कार्यात्मक एंडोमेट्रयम के प्रत्यारोपण द्वारा शुरू किया जाता है । एक्टोपिक घावों के बढ़ने और जीर्ण श्रोणि दर्द और बांझपन1के लिए अग्रणी भड़काऊ प्रक्रियाओं को प्रेरित । यह अनुमान है कि प्रजनन आयु की महिलाओं के 10 से 15% तक endometriosis2 से प्रभावित हैं, और यह लगभग 40 में मौजूद है-50% महिलाओं के3। endometriosis के लिए वर्तमान औषधीय उपचार पूरी तरह से घावों के उन्मूलन और साइड इफेक्ट से मुक्त नहीं करने में असमर्थ हैं4,5. अधिक कुशल चिकित्सा के लिए अनुसंधान इस तरह से endometriosis के मौजूदा पशु मॉडल के शोधन की आवश्यकता है कि मानव घावों को उचित रूप से नकल की जा सकती है, और दूसरों के बीच घाव आकार पर यौगिकों के प्रभाव बारीकी से मूल्यांकन किया जा सकता है ।
प्राइमेट मॉडल अस्थानिक घावों का imstologically समान और मनुष्यों के रूप में समान साइटों पर में endometriosis की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है6,7,8; हालांकि, नैतिक चिंताओं और उच्च आर्थिक प्राइमेट्स उनके उपयोग की सीमा के साथ प्रयोग से संबंधित लागत9। नतीजतन, छोटे जानवरों का उपयोग, विशेष रूप से कृंतकों, endometriosis के vivo मॉडल के कार्यान्वयन के लिए इष्ट के रूप में यह10,11व्यक्तियों की बड़ी संख्या के साथ अध्ययन की अनुमति देता है जारी है । endometriosis या तो कृंतक गर्भाशय सींग (“समजात मॉडल”)12,13 या मानव एंडोमेट्रियल/endometriosis ऊतक अस्थानिक साइटों के लिए प्रत्यारोपण द्वारा इन पशुओं में प्रेरित किया जा सकता है (विषमजातीय मॉडल)14 . मनुष्यों के विपरीत, कृंतकों उनके एंडोमेट्रियल ऊतक शेड नहीं है और इस तरह endometriosis इन प्रजातियों में सहज रूप से विकसित नहीं किया जा सकता है । इसलिए, endometriosis के समजात माउस मॉडल तथ्य यह है कि प्रत्यारोपित अस्थानिक माउस गर्भाशय ऊतक मानव endometriosis घावों की विशेषताओं को प्रतिबिंबित नहीं करता है की वजह से आलोचना की गई है15.
endometriosis के उपयुक्त शरीर क्रिया विज्ञान endometriosis के विषमजातीय मॉडल में नकल की जा सकती है जहां ताजा मानव एंडोमेट्रियल टुकड़े immunoकी कमी जानवरों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं । पारंपरिक विषमजात मॉडलों में, ब्याज के यौगिकों के उपचारात्मक प्रभाव सामान्यतः कैलिपर्स के उपयोग के साथ घाव के आकार के आकलन द्वारा अंत बिंदु पर मूल्यांकन कर रहे हैं16. एक स्पष्ट सीमा है कि, इस तरह के रूप में, समापन बिंदु पशु मॉडल समय के साथ प्रत्यारोपण गतिशीलता या एंडोमेट्रियल घाव के विकास का अध्ययन करने की अनुमति नहीं है । एक अतिरिक्त सीमा है कि कैलिपर्स का उपयोग घाव आकार की सटीक माप की अनुमति नहीं है । वास्तव में, मानक त्रुटि कैलिपर्स द्वारा प्रदान की एक ही श्रेणी में है (यानी, मिलीमीटर) घावों के आकार के रूप में चूहों में प्रत्यारोपित, इस प्रकार इन उपकरणों की क्षमता सीमित आकार में वास्तविक विविधताओं का पता लगाने के लिए.
आदेश में ऐसी सीमाओं पर काबू पाने के लिए, इस के साथ साथ, हम endometriosis के एक विषमजातीय माउस मॉडल की पीढ़ी का वर्णन जिसमें प्रत्यारोपित मानव ऊतक एक रिपोर्टर एम-चेरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस इंजीनियर है । एक उचित छवि प्रणाली के साथ फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने के वास्तविक समय में अपने आकार के एक साथ परिमाणन के साथ घाव स्थिति की गैर इनवेसिव निगरानी सक्षम बनाता है । इस प्रकार, हमारे मॉडल स्पष्ट लाभ प्रदान करता है जब पारंपरिक समापन बिंदु मॉडल की तुलना में यह वास्तविक समय गैर इनवेसिव निगरानी और अधिक उद्देश्य और घाव के आकार में बदलाव की सटीक अनुमान प्रदर्शन करने की संभावना का अवसर लाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ विस्तृत प्रोटोकॉल endometriosis के एक पशु मॉडल है जिसमें घावों वास्तुकला प्रत्यारोपण की वास्तुकला संरक्षित है whilst एक साथ mcherry द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के वास्तविक समय आकलन की अनुमति के कार्या?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था स्पेनी अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के miguel servet कार्यक्रम के माध्यम से [CP13/00077] feder द्वारा cofounded (यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष) और डॉ आर gómez को संमानित किया गया और साथ ही कार्लोस III स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा संमानित डॉ आर gómez करने के लिए [PI14/00547 and PI17/02329] और प्रो A. cano करने के लिए [PI12/02582] ।
Materials
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
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