تحليل لغزو خلايا السرطان والمنتشر لمكافحة المخدرات فحص استخدام صفيف المائية الصغيرة-الدائرة (همكا)-على أساس لوحات
Summary
صفيحة تصوير على أساس همكا تعرض للغزو مقايسة الأداء. وتيسر هذه اللوحة تشكيل الماغنيسيوم الورم (3D) ثلاثي الأبعاد والقياس من غزو خلايا السرطان في المصفوفة خارج الخلية (ECM). التحديد الكمي المقايسة غزو يتحقق عن طريق تحليل شبه التلقائي.
Abstract
من المعروف أن يسبب 90% فتك السرطان سرطان خبيث. ورم خبيث هو عملية متعددة المراحل الذي يبدأ مع الاختراق/غزو الخلايا السرطانية إلى الأنسجة المجاورة. وهكذا، الغزو خطوة حاسمة في ورم خبيث، مما يجعل الغزو عملية البحث والتطوير المتنقل لمكافحة المخدرات، هامة للغاية. ولمعالجة هذا الطلب، هناك حاجة إلى وضع نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر الذي تقليد الهندسة المعمارية للأورام الصلبة وبهم المكروية أوثق إلى في فيفو الدولة من جهة، ولكن في نفس الوقت يمكن استنساخه وقوية ومناسبة قياسات المحتوى عالية وعالية الغلة. حاليا، معظم غزو فحوصات الانكفاء على التكنولوجيات المتطورة موائع جزيئية وكافية للبحث ولكن ليس لفحص المخدرات كبيرة الحجم. فحوصات أخرى باستخدام الأجهزة المستندة إلى اللوحة مع الماغنيسيوم فردية منعزلة في كل بئر المواد المستهلكة وحجم العينة منخفضة لكل شرط. وهدف البروتوكول الحالي توفير نظام يستند إلى الخلية 3D المحاكاة البيولوجية البسيطة واستنساخه لتحليل القدرات الغزو في إعداد كبيرة من السكان من الماغنيسيوم الورم. قمنا بتطوير نموذج ثلاثي الأبعاد للمقايسة غزو استناداً إلى لوحة التصوير همكا للبحوث المتعلقة بغزو الورم واكتشاف الأدوية المضادة المنتشر. ويتيح هذا الجهاز إنتاج الماغنيسيوم موحدة عديدة كل بئر (حجم العينة عالية كل شرط) محاطة بمكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، بينما بشكل مستمر وفي نفس الوقت مراقبة وقياس الماغنيسيوم في القرار عنصر مفرد للمتوسطة فحص الإنتاجية المنتشر لمكافحة المخدرات. هذا المنهاج يرد هنا بإنتاج الماغنيسيوم هيلا و MCF7 لتجسد خلية مفردة والغزو الجماعي. نحن مقارنة تأثير حمض الهيالورونيك المكون إدارة المحتوى في المؤسسة (ها) على قدرة الكولاجين المحيطة الماغنيسيوم الحلة الغازية. وأخيراً، نقدم فيسيتين (غزو المانع) هيلا الماغنيسيوم وأكسيد النيتريك (لا) (غزو المنشط) الماغنيسيوم MCF7. ويتم تحليل النتائج بالبرامج الداخلية التي تمكن من تحليل شبه التلقائي وبسيطة وسريعة مما يسهل فحص المعلمة متعددة.
Introduction
السرطان الموت تعزى أساسا إلى نشر خلايا المنتشر إلى أماكن بعيدة. الكثير من الجهود في معالجة السرطان التركيز على استهداف أو منع تشكيل المستعمرات المنتشر وتطور المرض المنتشر النظامية1. سرطان الخلية الهجرة خطوة حاسمة في عملية استئصال ورم خبيث، وبالتالي، من البحوث المتعلقة بتتالي غزو السرطان مهم جداً وشرط أساسي لإيجاد العلاجات المضادة المنتشر.
قد تم العثور على استخدام نماذج حيوانية كأدوات لدراسة المرض المنتشر لتكون مكلفة للغاية وليس دائماً ممثلة للورم في البشر. وعلاوة على ذلك، طبولوجيا المكروية خارج الخلية والميكانيكا وتكوينها بشدة يؤثر سرطان الخلية السلوك2. نظراً لطبيعتها في فيفو نماذج عدم القدرة على فصل والسيطرة على هذه المعلمات المحددة التي تسهم في غزو السرطان وورم خبيث، هناك حاجة للمحاكاة البيولوجية يمكن السيطرة عليها في المختبر نماذج.
أجل السرطاني على الأجهزة البعيدة، يجب أن يحمل الخلايا السرطانية السمات المظهرية المهاجرة والغازية التي يمكن أن تكون هدفا للعلاج. ومع ذلك، منذ تقليد نماذج السرطان في المختبر معظم الميزات الفعلية من الأورام الصلبة3، أنها صعبة للغاية لكشف تعمل فسيولوجيا ذات الصلة. وبالإضافة إلى ذلك، عدم تجانس المظهرية التي توجد داخل الورم، يملي الحاجة إلى تحليل الهجرة ورم في القرار عنصر مفرد من أجل اكتشاف العلاجات الموجهة النمط الظاهري، على سبيل المثال، عن طريق استهداف الخلية الشروع في ورم خبيث السكان داخل الأورام غير متجانسة4.
ويجري دراسة حركية الخلية والهجرة الجماعية أساسا في ثقافات أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية على الأسطح المستوية متجانسة. هذه النماذج الخلوية التقليدية لسرطان الخلية الهجرة تستند إلى تحليل السكان من الخلايا الفردية الغازية من خلال الأغشية وإدارة المحتوى في المؤسسة مكونات5، ولكن في مثل هذه الأنظمة، لا يمكن أن تكون الاختلافات الجوهرية بين خلايا فردية درس. توليد الماغنيسيوم 3D أما عبر السقالات أو في هياكل صغيرة خالية من السقالة تعتبر متفوقة يعني بدراسة الورم الخلية النمو والسرطان غزو6،،من78. بيد أن معظم النظم 3D ليست مناسبة لتنسيقات عالية الإنتاجية والتفاعل بين الوكالات كروي عادة لا يمكن أن يتحقق منذ الماغنيسيوم فردية منعزلة يتم إنشاؤها في كل الدقيقة، حسنا9. الدراسات الحديثة المتعلقة بهجرة سرطان تستند إلى موائع جزيئية الأجهزة3،10،،من1112، ولكن هذه متطورة موائع جزيئية صعبة لإنتاج أدوات ولا تستخدم لارتفاع الإنتاجية الفحص (HTS) الغازية لمكافحة المخدرات.
اثنين الرئيسية تعمل، الهجرة الخلية الجماعية والفردية، والتي تلعب دوراً في التغلب على الحاجز ECM الخلايا السرطانية وغزو الأنسجة المجاورة، وقد تم إثبات13،14، كل عرض متميزة المورفولوجية الخصائص والآليات البيوكيميائية والجزيئية والوراثية. وباﻹضافة إلى ذلك، لوحظت شكلين لترحيل الخلايا السرطانية، مثل تنتجها الخلايا الليفية واميبيه، في كل النمط الظاهري. منذ على حد سواء، تعمل الغزو وطرق الهجرة، تتحدد أساسا بالخصائص المورفولوجية، هناك حاجة الخلوية نماذج هذا الكشف على أساس تصوير تمكين وفحص جميع أشكال الغزو الورم وتهاجر الخلايا.
والهدف العام للطريقة الحالية تقديم المحاكاة البيولوجية البسيطة واستنساخه 3D في المختبر نظام يستند إلى الخلية لتحليل القدرات الغزو في إعداد كبيرة من السكان من الماغنيسيوم الورم. هنا، نحن نقدم لوحة 6-جيدا التصوير على أساس همكا للبحوث المتعلقة بغزو الورم والعلاج المضادة المنتشر. التكنولوجيا تمكن تشكيل عدد كبير من الماغنيسيوم الورم 3D موحدة (450 كل بئر) في بنية مايكرو-دوائر (MC) المائية. مختلف مكونات ECM تضاف إلى الصفيف كروي لتمكين غزو الخلايا في البيئة المحيطة. ويرصد باستمرار المراقبة القصيرة الأجل والطويلة الأجل لنفس الخلايا الفردية الماغنيسيوم/الغازية عملية الغزو ويسهل توصيف الخصائص المورفولوجية وتلطيخ الفلورسنت واسترجاع الماغنيسيوم محددة عند أي نقطة. منذ الماغنيسيوم عديدة مشاركة مساحة والمتوسطة، من الممكن التفاعل عن طريق الجزيئات القابلة للذوبان بين الماغنيسيوم الفردية وتأثيرها على بعضها البعض. يتم إجراء تحليل صورة شبه تلقائية باستخدام MATLAB شفرة داخلية تمكن من جمع كمية كبيرة من البيانات أسرع وأكثر كفاءة. المنهاج يسهل قياس دقيقة وفورية لخلايا عديدة الماغنيسيوم/الغازية بطريقة فعالة من حيث وقت، السماح بفحص الإنتاجية المتوسطة لغزو لمكافحة المخدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
أنه تم توثيقه جيدا أن الكائنات الحية، تتميز بمنظمتهم متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد المعقدة متميزة تماما عن الخلايا أحادي الطبقة 2D استخداماً مثقف، وإذ تشدد على الحاجة الماسة إلى استخدام النماذج الخلوية التي تحاكي الوظائف أفضل وفحص عمليات الحي للمخدرات. ، الماغنيسيوم متعددة الثقافات أورج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل وصية شمعون موشي وجوديث ويسبرودت.
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
References
- Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
- Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
- Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
- Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
- Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
- Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
- Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
- Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
- Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
- Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
- Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
- Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
- Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
- Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
- Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
- Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
- Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).
- Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
- Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
- Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
- Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
- Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
- Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
- Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
- Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
- Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
- Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
- Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
- Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).
