がん細胞の浸潤と転移防止薬剤のスクリーニングのハイドロゲル マイクロチャンバー アレイを用いた (HMCA) の解析-ベース プレート
Summary
HMCA ベースのイメージング プレートは、浸潤アッセイ パフォーマンスが提示されます。このプレートは、三次元 (3 D) 腫瘍スフェロイドの形成と細胞外マトリックス (ECM) に癌細胞の測定を促進します。浸潤アッセイの定量化は、半自動解析によって実現されます。
Abstract
がんの転移がん致死率の 90% を引き起こす知られています。転移は、周辺の組織に腫瘍細胞の浸透・浸潤を開始する多段プロセスです。したがって、侵略は侵略プロセス研究と抗転移治療薬の開発の非常に重要なを作る転移の重要なステップです。この需要に対処するため固形腫瘍のアーキテクチャを模倣する 3 Dの in vitroモデルを開発する必要性があるし、1 つの手が同時に生体内の状態に最も密接に彼らの微小環境が再現性の高い、堅牢な適した高収量と高糖度を計測。現在、ほとんどの浸潤アッセイは頼る十分ですが洗練されたマイクロ流体技術研究ではなく、大量の薬剤のスクリーニング。他のアッセイ プレート ベースのデバイスを用いた各ウェルに分離個々 スフェロイド材料消費と条件ごとの低いサンプル サイズを持っています。現在のプロトコルの目的は、腫瘍回転楕円体の大規模な集団で侵攻能力の分析のためシンプルで再現性のある生物模倣型 3 D セル ベースのシステムを提供することです。HMCA イメージング プレート腫瘍浸潤性および抗転移性薬剤の発見の研究に基づく侵略の試金のための 3 D モデルを作成しました。このデバイスにより、連続と同時に観察し、媒体の単一要素の解像度で回転楕円体を測定しながら ECM コンポーネントに囲まれた多数の制服スフェロイド (条件あたりの高いサンプル サイズ) ウェルあたりの生産抗転移薬のスクリーニング。このプラットフォームは、単一セルおよび集団の侵入を実証の hela 細胞と MCF7 回転楕円体の生産によってここで紹介です。Hela 細胞スフェロイドを取り巻くコラーゲンの侵襲的な能力で ECM 成分ヒアルロン酸 (HA) の影響を比較します。最後に、紹介 Fisetin (侵入阻害剤) hela 細胞スフェロイドと一酸化窒素 (NO) (侵略アクティベーター) MCF7 回転楕円体に。結果は、マルチパラ メーター検査を容易にする半自動、シンプルで高速な解析を可能にする社内のソフトウェアによって分析されます。
Introduction
癌死は遠い場所に転移細胞の普及に主に起因します。がんの治療で多くの努力をターゲットまたは転移性コロニーの形成と全身の転移性疾患1の進行予防に焦点を当てます。がん細胞の遊走は腫瘍転移プロセスの重要なステップ、したがって、がん浸潤翼列の研究は非常に重要な抗転移治療を見つけることへの前提条件。
転移性疾患を研究するためのツールとして動物モデルの使用は、非常に高価で、常に人間の腫瘍の代表ではないに発見されています。さらに、細胞外微小環境のトポロジー、力学や構成強く癌細胞の動作2を影響します。体内モデルは本質的に分離し、癌の浸潤・転移に貢献するような特定のパラメーターを制御する能力を欠いている、制御可能な模倣の in vitroモデルの必要性があります。
遠隔臓器に転移するためにがん細胞は治療の対象にすることができます渡り鳥や侵襲性の分化形質を表わさなければなりません。しかし、ほとんどのがんの in vitroモデルが固体腫瘍3の実際の機能を模倣しないので、生理学的に関連する表現型を検出する非常にやりがいのあります。さらに、表現型の多様性は、腫瘍内に存在する指示転移開始細胞によって表現型指示療法、例えばを発見するために要素が 1 つの解像度での腫瘍移行の分析の必要性異種腫瘍4内人口。
細胞の運動性と集団移動の調査は均一な平面の表面で上皮細胞の単層培養に主にです。がん細胞遊走のこれらの従来の携帯電話モデルは、個々 の細胞膜と ECM コンポーネント5、侵入の人口分析に基づいているが、このようなシステムで個々 の細胞の本質的な違いをすることはできません。勉強しました。優れた腫瘍を研究する手段として足場を経由またはスキャフォールド フリー マイクロ構造のいずれかと見なされます生成 3 D 回転楕円体セル成長および癌浸潤6,7,8。しかし、ほとんどの 3 D システム、高スループットの形式には適していません、分離個々 の回転楕円体、各マイクロも9で生成されますので通常回転楕円体間相互作用を達成することはできません。癌の移行を含む最近の研究は、マイクロ流体デバイス3,10、11,12に基づきます、しかし、これらはマイクロ ツールを生成しにくい、できない洗練されました。ハイスループットス クリーニング (HTS) 反侵襲的な薬の使用。
2 つの主な表現、集団と個々 の細胞遊走と ECM バリアを克服する腫瘍細胞の役割を担い、周辺の組織に侵入されている実証13,14、それぞれ明確な表示を形態学的、生化学的な分子および遺伝のメカニズム、特徴。さらに、移行する腫瘍細胞、線維芽細胞のようなアメーバの 2 つの形式は、それぞれの表現型の観察されます。両方以来侵略の表現型と移行モードは主に形態学的性質によって定義されます、携帯の必要性モデル イメージング ベースの検出を有効にして、細胞の浸潤と移行のすべての形態の検討があります。
現在のメソッドの全体的な目標は、腫瘍回転楕円体の大規模な集団で侵攻能力の分析のセルベースのシステム 3 D体外シンプルで再現性のある生体模倣を提供することです。腫瘍浸潤性および抗転移療法の研究 HMCA ベース 6 ウェル イメージング プレートを紹介します。ハイドロゲル マイクロ室 (MC) 構造における制服 3 D 腫瘍スフェロイド (ウェルあたり 450) の多数の形成を実現します。ECM のさまざまなコンポーネントは、周囲の環境への細胞の侵入を有効にするスフェロイド アレイに追加されます。浸潤過程同じ個々 に回転楕円体/侵入細胞の短期および長期観察によって常時監視し、形態的特性、蛍光染色、任意の時点で特定の回転楕円体の検索が容易になります。多数の回転楕円体は、空間とメディアを共有するので水溶性の分子を介して個々 の回転楕円体と互いへの影響の相互作用が可能です。半自動画像解析は、大量のデータの高速かつ効率的コレクションを可能にする社内の MATLAB のコードを使用して行われます。プラットフォーム反侵略薬の中のスクリーニングを許可する、時間効率の良い方法で多数の回転楕円体/浸潤細胞の正確な同時測定が容易になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
それも記載の生きている有機体、複雑な 3 D 多細胞組織によって特徴付けられるより良い機能を模倣細胞モデルを使用する重大な必要性を強調、一般的に使用される 2次元単層培養細胞とは全く異なる・薬物の生きている有機体のプロセスの検診します。最近では、チップ上の臓器、organoids 切片培養スフェロイドは標準化された薬剤の発見の使用のために導入された8をされ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、モシェ ・ シモンとジュディス Weisbrodt の遺贈によってサポートされます。
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
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