कैंसर सेल आक्रमण और विरोधी मेटास्टेटिक दवा Hydrogel सूक्ष्म चैंबर सरणी (HMCA) का उपयोग कर स्क्रीनिंग के विश्लेषण-प्लेट्स आधारित
Summary
एक HMCA आधारित इमेजिंग प्लेट आक्रमण परख प्रदर्शन के लिए प्रस्तुत किया है । इस प्लेट तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर spheroids और extracellular मैट्रिक्स (ECM) में कैंसर कोशिका आक्रमण की माप के गठन की सुविधा । आक्रमण परख ठहराव अर्द्ध स्वचालित विश्लेषण द्वारा हासिल की है ।
Abstract
कैंसर मेटास्टेसिस कैंसर की मृत्यु के ९०% कारण जाना जाता है । मेटास्टेसिस एक multistage प्रक्रिया है जो पड़ोसी ऊतक में प्रवेश/ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण के साथ शुरू होता है । इस प्रकार, आक्रमण मेटास्टेसिस में एक महत्वपूर्ण कदम है, आक्रमण प्रक्रिया अनुसंधान और विरोधी मेटास्टेटिक दवाओं के विकास, अत्यधिक महत्वपूर्ण बना । इस मांग को संबोधित करने के लिए एक की जरूरत है इन विट्रो मॉडल जो ठोस ट्यूमर की वास्तुकला की नकल और उनके microenvironment सबसे निकटता में vivo राज्य में एक हाथ पर, लेकिन एक ही समय में reproducible, मजबूत और के लिए उपयुक्त हो उच्च उपज और उच्च सामग्री माप । वर्तमान में, सबसे आक्रमण परख परिष्कृत microfluidic प्रौद्योगिकियों जो अनुसंधान के लिए पर्याप्त नहीं बल्कि उच्च मात्रा दवा स्क्रीनिंग के लिए कर रहे है पर झुक जाते हैं । प्लेट का उपयोग अन्य परख-अलग व्यक्तिगत spheroids के साथ उपकरणों पर आधारित एक अच्छी तरह से सामग्री लेने वाले हैं और शर्त प्रति कम नमूना आकार है. वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य ट्यूमर spheroids की बड़ी आबादी में आक्रमण क्षमता के विश्लेषण के लिए एक सरल और reproducible biomimetic 3d कोशिका आधारित प्रणाली प्रदान करना है । हम आक्रमण परख के लिए एक 3 डी मॉडल ट्यूमर आक्रमण और विरोधी मेटास्टेटिक दवा खोज के अनुसंधान के लिए HMCA इमेजिंग प्लेट पर आधारित विकसित की है । यह डिवाइस (शर्त प्रति उच्च नमूना आकार) ECM घटकों से घिरा हुआ है, जबकि लगातार और एक साथ देख और मध्यम के लिए एकल तत्व संकल्प पर spheroids को मापने के प्रति अच्छी तरह से कई समान spheroids के उत्पादन को सक्षम बनाता है विरोधी मेटास्टेटिक दवाओं का प्रवाह स्क्रीनिंग । यह मंच यहाँ exemplifying एकल कोशिका और सामूहिक आक्रमण के लिए हेला और MCF7 spheroids के उत्पादन द्वारा प्रस्तुत किया गया है. हम ECM घटक hyaluronic एसिड के प्रभाव की तुलना कोलेजन के आसपास हेला spheroids के इनवेसिव क्षमता पर (हा) । अंत में, हम Fisetin (आक्रमण अवरोधक) हेला spheroids और नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) (आक्रमण उत्प्रेरक) MCF7 spheroids करने के लिए परिचय । परिणाम में घर सॉफ्टवेयर है जो अर्द्ध स्वचालित, सरल और तेजी से विश्लेषण जो बहु-पैरामीटर परीक्षा की सुविधा में सक्षम बनाता द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं ।
Introduction
कैंसर मृत्यु मेटास्टेटिक कोशिकाओं के प्रसार के लिए मुख्य रूप से दूर के स्थानों के लिए जिंमेदार ठहराया है । कैंसर के इलाज में कई प्रयासों को लक्षित करने या मेटास्टेटिक कालोनियों और प्रणालीगत मेटास्टेटिक रोग की प्रगति के गठन को रोकने पर ध्यान केंद्रित1। कैंसर सेल प्रवास ट्यूमर मेटास्टेसिस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है, इस प्रकार, कैंसर आक्रमण झरना के अनुसंधान बहुत महत्वपूर्ण है और विरोधी मेटास्टेटिक चिकित्सकीय खोजने के लिए एक शर्त है ।
मेटास्टेटिक रोग के अध्ययन के लिए उपकरणों के रूप में पशु मॉडलों का उपयोग बहुत महंगा पाया गया है और हमेशा मानव में ट्यूमर के प्रतिनिधि नहीं. इसके अलावा, extracellular microenvironment टोपोलॉजी, यांत्रिकी और संरचना दृढ़ता से कैंसर कोशिका व्यवहार को प्रभावित2। के बाद से vivo मॉडल में स्वाभाविक को अलग और ऐसे विशिष्ट मापदंडों जो कैंसर के आक्रमण और मेटास्टेसिस में योगदान को नियंत्रित करने की क्षमता की कमी है, वहां इन विट्रो मॉडल में नियंत्रणीय biomimetic के लिए एक की जरूरत है ।
आदेश में दूर के अंगों को metastasize करने के लिए, कैंसर की कोशिकाओं प्रवासी और इनवेसिव phenotypic लक्षण है जो चिकित्सा के लिए लक्षित किया जा सकता है प्रदर्शन करना चाहिए । हालांकि, के बाद से इन विट्रो कैंसर मॉडल ठोस ट्यूमर3की वास्तविक सुविधाओं की नकल नहीं करते हैं, यह बहुत शारीरिक रूप से प्रासंगिक phenotypes का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसके अलावा, ट्यूमर के भीतर मौजूद phenotypic विविधता, phenotype-निर्देशित उपचारों को खोजने के क्रम में एकल-तत्व रिज़ॉल्यूशन पर ट्यूमर माइग्रेशन का विश्लेषण करने की आवश्यकता को निर्धारित करता है, उदाहरण के लिए, मेटास्टेसिस-शुरुआत कक्ष को टार्गेट करके विषम ट्यूमर के भीतर जनसंख्या4.
कोशिका गतिशीलता और सामूहिक प्रवास का अध्ययन मुख्यतः उपकला कोशिकाओं की monolayer संस्कृतियों में सजातीय planar सतहों पर आयोजित किया जाता है । कैंसर सेल प्रवास के लिए इन पारंपरिक सेलुलर मॉडल अलग झिल्ली और ECM5घटकों के माध्यम से हमला कोशिकाओं के जनसंख्या विश्लेषण पर आधारित हैं, लेकिन ऐसी प्रणालियों में, व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच आंतरिक मतभेदों को नहीं किया जा सकता अध्ययन. 3 डी spheroids या तो पाड़ या पाड़ में मुक्त सूक्ष्म संरचनाओं के माध्यम से पैदा करने के लिए एक बेहतर ट्यूमर सेल विकास और कैंसर के आक्रमण6,7,8अध्ययन का मतलब के रूप में माना जाता है । हालांकि, सबसे 3 डी सिस्टम उच्च प्रवाह प्रारूपों के लिए उपयुक्त नहीं हैं, और अंतर-अंडाकार आकृति बातचीत आमतौर पर अलग अलग spheroids प्रत्येक सूक्ष्म अच्छी तरह से9में उत्पंन कर रहे है के बाद से प्राप्त नहीं किया जा सकता है । हाल ही में कैंसर प्रवास शामिल अध्ययन microfluidic उपकरणों3,10,11,12पर आधारित हैं, तथापि, इन परिष्कृत microfluidic उपकरण के लिए उत्पादन और नहीं कर सकते है मुश्किल विरोधी इनवेसिव दवाओं के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) के लिए इस्तेमाल किया जा ।
दो मुख्य phenotypes, सामूहिक और व्यक्तिगत सेल प्रवास है, जो ECM बाधा पर काबू पाने और पड़ोसी ऊतक हमलावर कोशिकाओं में एक भूमिका निभाते हैं,13,14प्रदर्शन किया गया है, प्रत्येक प्रदर्शित अलग रूपात्मक विशेषताओं, जैव रासायनिक, आणविक और आनुवंशिक तंत्र । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के पलायन के दो रूपों, fibroblast की तरह और amoeboid, प्रत्येक phenotype में मनाया जाता है । दोनों के बाद से, आक्रमण phenotypes और प्रवास मोड, मुख्य रूप से रूपात्मक गुणों द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, वहां सेलुलर मॉडल है कि इमेजिंग आधारित पता लगाने और ट्यूमर के आक्रमण के सभी रूपों और कोशिकाओं के स्थानांतरण की परीक्षा सक्षम करने के लिए एक की जरूरत है ।
वर्तमान विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक सरल और reproducible biomimetic 3 डी इन विट्रो सेल-आधारित प्रणाली ट्यूमर spheroids की बड़ी आबादी में आक्रमण क्षमता के विश्लेषण के लिए प्रदान करने के लिए है । यहां, हम ट्यूमर के आक्रमण और विरोधी मेटास्टेटिक चिकित्सा के अनुसंधान के लिए HMCA आधारित 6 अच्छी इमेजिंग प्लेट परिचय । प्रौद्योगिकी एक hydrogel माइक्रो चैंबर्स (MC) संरचना में वर्दी 3 डी ट्यूमर spheroids (४५० प्रति अच्छी तरह से) की बड़ी संख्या के गठन में सक्षम बनाता है । विभिन्न ECM घटकों अंडाकार आकृति सरणी में जोड़े जाते हैं आसपास के वातावरण में कोशिकाओं के आक्रमण को सक्षम करने के लिए. आक्रमण की प्रक्रिया लगातार एक ही व्यक्ति spheroids/आक्रमण कोशिकाओं के लघु और दीर्घकालिक अवलोकन द्वारा निगरानी की जाती है और रूपात्मक लक्षण वर्णन, किसी भी बिंदु पर फ्लोरोसेंट धुंधला और विशिष्ट spheroids की पुनर्प्राप्ति की सुविधा । के बाद से कई spheroids शेयर अंतरिक्ष और मध्यम, व्यक्तिगत spheroids और एक दूसरे पर उनके प्रभाव के बीच घुलनशील अणुओं के माध्यम से बातचीत संभव है । अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण में घर MATLAB कोड है जो डेटा की बड़ी राशि का तेजी से और अधिक कुशल संग्रह में सक्षम बनाता है का उपयोग करके किया जाता है । मंच एक समय कुशल तरीके से, विरोधी आक्रमण दवाओं के मध्यम प्रवाह स्क्रीनिंग की अनुमति देने में कई spheroids/हमलावर कोशिकाओं के सटीक, एक साथ माप की सुविधा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि रहने वाले जीवों, उनके जटिल 3d कोशिकीय संगठन द्वारा विशेषता काफी अलग है आमतौर पर इस्तेमाल किया 2d monolayer प्रसंस्कृत कोशिकाओं से, महत्वपूर्ण सेलुलर मॉडल जो बेहतर कार्यों की नकल क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को मोशे शिमॉन और जूडिथ Weisbrodt के वसीयत ने सपोर्ट किया है.
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
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