En HMCA-basert bildebehandling plate er presentert for invasjonen analysen ytelse. Denne platen forenkler dannelsen av tredimensjonale (3D) svulst spheroids og måling av kreft cellen invasjonen i den ekstracellulære matrisen (EFM). Invasjonen analysen kvantifiseringen oppnås ved halvautomatisk analyse.
Kreft metastasering er kjent at 90% av kreft dødelighet. Metastasering er en flertrinns prosess som starter med penetrasjon/invasjonen av svulst cellene i nærliggende vev. Dermed er invasjonen et viktig skritt i metastasering, gjør invasjonen prosess forskning og utvikling av anti-metastatisk narkotika, stor betydning. For å møte denne etterspørselen, det er behov for å utvikle 3D i vitro modeller som imiterer arkitektur solide svulster og deres microenvironment nærmest til i vivo tilstand på den ene siden, men samtidig være reproduserbare, robust og egnet for høy kapasitet og høy innhold målinger. Foreløpig mest invasjonen analyser lene på sofistikerte microfluidic teknologi som er tilstrekkelig for forskning, men ikke for høyt volum narkotikarelaterte screening. Andre analyser plate-baserte enheter med isolerte individuelle spheroids i hver brønn er materiale forbruker og har lav utvalgsstørrelsen per betingelse. Målet med gjeldende protokollen er å gi en enkel og reproduserbar biomimetic 3D cellen-basert system for analyse av invasjonen kapasitet i store populasjoner av svulst spheroids. Vi utviklet en 3D-modell for invasjonen analysen basert på HMCA tenkelig plate til forskning av svulst invasjon og anti-metastatisk medisiner. Denne enheten kan mange uniform spheroids per brønn (høy utvalgsstørrelsen per betingelse) omgitt av ECM komponenter, mens kontinuerlig og samtidig observere og måle spheroids på ett element oppløsning for middels gjennomstrømming screening av anti-metastatisk narkotika. Denne plattformen er presentert her av produksjonen av HeLa og MCF7 spheroids for exemplifying enkelt celle og kollektive invasjonen. Vi sammenligne påvirkning av ECM komponent hyaluronic syre (HA) på invasiv kapasiteten av kollagen rundt HeLa spheroids. Til slutt, vi introdusere Fisetin (invasjonen hemmer) HeLa spheroids og nitrogenoksid (ingen) (invasjonen Aktivator) til MCF7 spheroids. Resultatene analyseres av Husets programvare som gjør halvautomatisk, enkel og rask analyse som gjør flere parameter eksamen.
Døden skyldes hovedsakelig til formidling av metastatisk celler til fjerntliggende steder. Mange anstrengelser i kreftbehandling fokusere på målretting eller hindre dannelsen av metastatisk kolonier og progresjon av systemisk metastaser1. Kreft celle migrasjon er et viktig skritt i svulst metastasering prosessen, dermed forskning kreft invasjonen cascade er svært viktig og en forutsetning for å finne anti-metastatisk therapeutics.
Bruk av dyr modeller som verktøy for å studere metastatisk sykdom har blitt funnet for å være svært dyrt og ikke alltid representative for svulst i mennesker. Videre er påvirke den ekstracellulære microenvironment topologi, mekanikk og komposisjon sterkt kreft cellen oppførsel2. Siden i vivo modeller iboende mangel evnen å skille og kontrollere slike spesifikke parametere som bidrar til kreft invasjon og metastasering, er det behov for kontrollerbar biomimetic i vitro modeller.
For å kunne metastase å fjerne organer, må kreftceller utstilling vandrende og invasive fenotypiske trekk som kan målrettes for terapi. Men siden de fleste i vitro kreft modeller ikke etterligne faktiske funksjonene i solide svulster3, er det svært utfordrende å oppdage fysiologisk relevante fenotyper. I tillegg dikterer til fenotypiske heterogene som finnes i svulsten, behovet for å analysere svulst overføring på ett element oppløsning for å oppdage fenotypen rettet behandlinger, for eksempel ved å målrette metastasering-starte cellen befolkningen i heterogene svulster4.
Studiet av cellen motilitet og kollektiv migrasjon gjennomføres hovedsakelig monolayer kulturer av epitelceller på homogen Plane overflater. Disse konvensjonelle mobilnettet modeller for kreft celle migrasjon er basert på befolkningen analyse av enkeltceller invadere gjennom membraner og ECM komponenter5, men i slike systemer, iboende forskjellene mellom individuelle celler ikke studerte. Genererer 3D spheroids via stillaser eller stillaset uten mikro-strukturer er regnet som en overlegen betyr å studere svulst celle vekst og kreft invasjonen6,7,8. Men mest 3D systemer er ikke egnet til høy gjennomstrømning formater, og mellom spheroid interaksjon vanligvis oppnås ikke siden isolerte individuelle spheroids genereres i hver mikro-og9. Studier med kreft overføringen er basert på microfluidic enheter3,10,11,12, men disse sofistikerte microfluidic verktøy er vanskelig å produsere og ikke kan brukes for høy gjennomstrømning screening (HTS) av anti-invasiv narkotika.
To viktigste fenotyper, kollektive og individuelle celle migrasjon, som spiller en rolle i kreftceller overvinne ECM barrieren og invadere nærliggende vev, har blitt demonstrert13,14, hver viser atskilte morfologiske egenskaper, biokjemiske, molekylære og genetiske mekanismer. I tillegg er to former for overføring kreftceller, fibroblast-like og amoeboid, observert i hver fenotypen. Siden både invasjonen fenotyper og migrasjon moduser, defineres hovedsakelig av morfologiske egenskaper, det er behov for mobilnettet modeller som aktiverer imaging-basert oppdagelsen og undersøkelse av alle former for svulst invasjon og migrere celler.
Det overordnede målet med det aktuelle metoden er å gi en enkel og reproduserbar biomimetic 3D i vitro cellen-basert system for analyse av invasjonen kapasitet i store populasjoner av svulst spheroids. Her introduserer vi HMCA-baserte 6-og bildebehandling platen til forskning av svulst invasjon og anti-metastatisk terapi. Teknologien gjør det mulig for dannelsen av et stort antall uniform 3D svulst spheroids (450 per brønn) i en hydrogel mikro-kammer (MC) struktur. Ulike ECM-komponenter er lagt til spheroid matrisen aktivere invasjonen av cellene i omgivelsene. Invasjonen er kontinuerlig overvåket av kort – og langsiktige observasjon av samme personlige spheroids/invadere celler og muliggjør morfologiske karakterisering, fluorescerende flekker og gjenfinning av bestemt spheroids når som helst. Siden mange spheroids deler plassen og medium, er kommunikasjon via løselige molekyler mellom individuelle spheroids og deres innvirkning på hverandre mulig. Halvautomatisk bildeanalyser utføres ved hjelp av interne MATLAB kode som gjør det raskere og mer effektiv samling av store mengder data. Plattformen forenkler nøyaktig, samtidig måling av mange spheroids/invadere celler på en tidkrevende måte, slik at medium gjennomstrømming screening av anti-invasjonen narkotika.
Det er godt dokumentert at levende organismer, preget av komplekse 3D flercellet organisasjonen er ganske forskjellige fra de vanlige 2D monolayer kultivert cellene, understreker avgjørende måtte bruke mobilnettet modeller som bedre etterligner funksjonene og prosesser av den levende organismen for narkotika screening. Nylig har flercellet spheroids, organotypic kulturer, organoids og organer på-chip vært introdusert8 for bruk i standardiserte medisiner. Men truer 3D flercellet modellens stor …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av testamentere Moshe Shimon og Judith Weisbrodt.
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |