Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı
Summary
HMCA tabanlı görüntüleme plaka işgali tahlil performans için sunulmaktadır. Bu plaka üç boyutlu (3D) tümör pulcuklarının oluşumu ve hücre dışı matriks (ECM) içine kanser hücre işgalinin ölçüm kolaylaştırır. İstila tahlil miktar yarı otomatik analizi ile elde edilir.
Abstract
Kanser metastaz kanser ölümcül % 90’ı neden olduğu bilinmektedir. Metastaz tümör hücreleri penetrasyon/işgali ile komşu dokusuna başlatır çok aşamalı bir süreçtir. Böylece, istila istila işlem araştırma ve geliştirme Anti-metastatik ilaçların son derece önemli hale metastaz içinde önemli bir adımdır. Bu talebi adrese, solid tümör mimarisini taklit 3D vitro modellerinin geliştirilmesi için bir ihtiyaç olduğunu ve onların microenvironment vivo içinde devlet bir yandan ama aynı zamanda en yakın için tekrarlanabilir, sağlam ve uygun yüksek verim ve yüksek içerik ölçümleri. Şu anda, çoğu işgal deneyleri yeterli olan sofistike mikrosıvısal teknolojileri yalın araştırma için ancak yüksek hacimli uyuşturucu tarama için. Her iyi izole bireysel pulcuklarının ile plaka tabanlı cihazlar kullanarak diğer deneyleri malzeme tüketen ve koşul başına düşük örnek boyutu var. Geçerli protokol amacı işgal kapasitesi tümör pulcuklarının büyük nüfus analizi için basit ve tekrarlanabilir biomimetic 3D hücre tabanlı sistem sağlamaktır. HMCA görüntüleme plaka tümör işgali ve Anti-metastatik ilaç keşfi araştırma için temel işgali tahlil için 3B modeli geliştirdik. Bu cihaz ise sürekli olarak ve aynı anda gözlemlemek ve orta için tek öğe çözünürlükte pulcuklarının ölçme ECM bileşenleri tarafından çevrili sayısız Tekdüzen pulcuklarının iyi (koşul başına yüksek örnek boyutu) başına üretimi sağlar üretilen iş Anti-metastatik uyuşturucu testi ile taranması. Bu platform burada tek hücre ve toplu istilası örnekli için HeLa ve MCF7 pulcuklarının üretim tarafından sunulan. HeLa pulcuklarının çevreleyen kollajen invaziv kapasitesini ECM bileşen hyaluronik asit (HA) etkisini karşılaştırın. Son olarak, biz Fisetin (Invasion inhibitörü) HeLa pulcuklarının ve nitrik oksit (NO) (Invasion harekete geçirmek) MCF7 pulcuklarının için tanıtın. Sonuçlar çok parametreli muayene kolaylaştırır yarı otomatik, basit ve hızlı analiz sağlayan kurum içi yazılım tarafından incelenir.
Introduction
Kanser ölüm esas olarak uzak konumlara metastatik hücreleri yayılması atfedilir. Kanser tedavisinde birçok çabaları hedefleme veya metastatik kolonileri oluşumu ve sistemik metastatik hastalık1ilerlemesini engelleyen odaklanmak. Kanser hücre göç tümör metastazı işleminde önemli bir adımı, böylece, kanseri istila cascade araştırma çok önemli ve bir Anti-metastatik tedavi bulmak için ön koşul.
Metastatik hastalık çalışmak için araçlar olarak hayvan modelleri kullanımını çok pahalı ve değil her zaman temsilcisi insanlarda tümör olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, hücre dışı microenvironment topoloji, mekanik ve kompozisyon güçlü kanser hücre davranış2etkiler. Vivo modelleri doğal olarak ayırmak ve kanser işgali ve metastaz için katkıda bulunmak gibi belirli parametreleri denetlemek için yetenek eksikliği olduğu kontrol edilebilir biomimetic vitro modelleri için bir ihtiyaç.
Uzak organlara metastaz için kanser hücrelerinin tedavi için hedeflenen göçmen ve invaziv fenotipik özellikleri sergilemek gerekir. Çoğu vitro kanser modelleri solid tümör3gerçek özelliklerini taklit değil, ancak, fizyolojik ilgili fenotipleri tespit etmek çok zor çünkü. Buna ek olarak, içinde tümör, var fenotipik heterojenite dikte tümör geçiş tek öğe çözünürlükte metastaz başlatılıyor hücre hedefleyerek terapiler, örneğin, fenotip yönetmen bulmak için analiz etmek için ihtiyaç Türdeş olmayan tümörler4içinde nüfus.
Hücre hareketliliği ve toplu geçiş çalışma öncelikle monolayer kültürler homojen düzlemsel yüzeylerde epitel hücrelerinin yürütülmektedir. Bu klasik hücresel modellere kanser hücre geçiş için tek tek hücrelere membranlar ve ECM bileşenleri5işgal nüfus analizi temel alır ancak tür sistemlerde, tek tek hücreler arasındaki içsel farklılıklar olamaz okudu. İskele üzerinden veya iskele-Alerjik mikro-yapıların olarak kabul edilir olarak üstün bir tümör çalışmaya anlamına gelir getirici 3D pulcuklarının işgali6,7,8büyüme ve kanser hücre. Ancak, 3D sistemleri en yüksek işlem hacmi biçimlerine uygun değildir ve izole bireysel pulcuklarının her Mikro-Evet9‘ da üretilen bu yana arası küresel etkileşim genellikle elde edilemez. Son çalışmalar kanser geçiş içeren mikrosıvısal aygıtları3,10,11,12dayalı, ancak, bunlar araçlar üretmek zordur ve cant mikrosıvısal sofistike (HTS) Anti-invaziv ilaçların eleme yüksek üretilen iş için kullanılabilir.
Tümör hücreleri ECM bariyer üstesinden bir rol oynamaktadır ve komşu doku istila gösterdiği13,14her farklı görüntüleme, morfolojik olmuştur iki ana fenotipleri, kolektif ve bireysel hücre göç, Özellikleri, biyokimya, moleküler ve genetik mekanizmaları. Buna ek olarak, geçirme tümör hücreleri, fibroblast benzeri ve protozlar, iki türde her fenotip gözlenir. Her ikisi de beri işgal fenotipleri ve geçiş modları, özellikle morfolojik özelliklerine göre tanımlanır, cep için bir ihtiyaç bu etkinleştir görüntüleme tabanlı algılama modelleri ve tümör işgali ve geçirdiğiniz her türlü incelenmesi hücreleri.
Geçerli yöntem genel amacı işgal kapasitesi tümör pulcuklarının büyük nüfus analizi için bir basit ve tekrarlanabilir biomimetic 3D vitro hücre tabanlı sistem sağlamaktır. Burada, HMCA tabanlı 6-iyi görüntü plaka tümör işgali ve Anti-metastatik terapi araştırma için tanıtmak. Teknolojisi, tek tip 3D tümör pulcuklarının (450 başına iyi) hidrojel mikro-Odalar (MC) yapısında çok sayıda oluşumunu sağlar. Çeşitli ECM bileşenleri hücreleri istila çevresini içine etkinleştirmek için küresel dizisine eklenir. İstila işlemi sürekli olarak kısa ve uzun vadeli gözlem aynı bireysel pulcuklarının/istila hücre tarafından izlenir ve morfolojik karakterizasyonu, floresan boyama ve herhangi bir noktada belirli pulcuklarının alınmasını kolaylaştırır. Bu yana çok sayıda pulcuklarının alanını ve orta paylaşır, bireysel pulcuklarının ve bir başka etkileri arasında çözünen molekülleri ile etkileşimi mümkündür. Yarı otomatik görüntü analizi daha hızlı ve daha verimli koleksiyonu büyük miktarda veri sağlayan kurum içi MATLAB kod kullanarak gerçekleştirilir. Platform orta üretilen iş tarama anti-Invasion ilaçların izin zaman verimli bir şekilde çok sayıda pulcuklarının/istila hücrelerinin doğru eş zamanlı ölçüm kolaylaştırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iyi belgelenmiş canlı organizmalar, onların karmaşık 3D Çokhücreli Organizasyon tarafından karakterize oldukça çok önemli fonksiyonları daha iyi taklit hücresel modelleri kullanmaya gerek vurgulayan kültürlü sık kullanılan 2D monolayer hücrelerden farklıdır ve uyuşturucu için canlı organizmanın süreçleri eleme. Son zamanlarda, çok hücreli pulcuklarının, organotypic kültürlerin, organoids ve organları-on-a-chip tanıtılan8 kullanılmak üzere standart ilaç ke?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Moshe Şimon ve Judith Weisbrodt miras tarafından desteklenir.
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
References
- Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
- Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
- Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
- Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
- Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
- Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
- Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
- Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
- Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
- Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
- Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
- Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
- Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
- Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
- Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
- Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
- Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).
- Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
- Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
- Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
- Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
- Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
- Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
- Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
- Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
- Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
- Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
- Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
- Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).
