Mondelinge intubatie van volwassen Zebrafish: een Model voor de evaluatie van de intestinale opname van bioactieve stoffen
Summary
Het protocol beschrijft intubating volwassen zebrafish met een biologische; dan ontleden en cytometry, confocal microscopie en qPCR in de darm voorbereiden. Met deze methode kunt beheer van biologische actieve stoffen ten aanzien van intestinale opname en de lokale immuun stimulus opgeroepen. Het is relevant voor het testen van de intestinale dynamiek van mondelinge mondhygiëne.
Abstract
De meeste ziekteverwekkers binnenvallen organismen via hun mucosa. Dit geldt met name in vis zoals ze worden voortdurend blootgesteld aan een omgeving van het microbiële-rijke water. De ontwikkeling van doelmatige methoden voor de mondelinge aflevering van immunostimulants en vaccins, die het immuunsysteem tegen besmettelijke ziekten activeren, is zeer wenselijk. Bij het uitwerken van profylactische tools, zijn goede experimentele modellen nodig voor het testen van hun prestaties. Hier, laten we een methode voor mondelinge intubatie van volwassen zebravis en een reeks procedures om te ontleden en de darm voorbereiden van cytometry, confocal microscopie en kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) analyse. Met dit protocol, kunnen we precies beheren volumes tot 50 µL vissen weegt ongeveer 1 g eenvoudig en snel, zonder nadelige gevolgen voor de dieren. Deze methode kan wij de directe in-vivo -opname van fluorescently geëtiketteerde verbindingen met de intestinale mucosa en de immunomodulerende capaciteit van dergelijke biologics in de lokale site na intubatie kunt verkennen. Door het combineren van downstream methoden zoals stroom cytometry, histologie, qPCR en confocale microscopie van de intestinale weefsel, kunnen we begrijpen hoe immunostimulants of vaccins steken de intestinale mucosa barrières kunnen, passeren de lamina propria, en het bereiken van de spier, een effect op de intestinale mucosale immuunsysteem uit te oefenen. Het model kan worden gebruikt om de kandidaat-mondelinge mondhygiëne en levering systemen of het plaatselijke effect van een oraal toegediende bioactieve verbinding testen.
Introduction
Het doel van dit artikel is om te beschrijven in detail een eenvoudige methode voor mondelinge intubatie van zebrafish, samen met nuttige bijbehorende downstream procedures. Mondelinge intubatie met behulp van de zebravis is uitgegroeid tot een praktisch model in de studie van infectieziekten dynamiek, orale vaccin/immunostimulant drug/nanoparticle opname en werkzaamheid en intestinale mucosale immuniteit. Bijvoorbeeld, is zebravis mondelinge intubatie gebruikt in de studie van Mycobacterium marinum en Mycobacterium peregrinum infectie1. Lovmo et al. ook met succes gebruikt dit model nanodeeltjes en M. marinum te leveren aan het maag-darmkanaal van volwassen zebrafish2. Bovendien, Chen et al. zebrafish mondelinge intubatie gebruikt om te tonen dat drugs ingekapseld door nanodeeltjes, wanneer door de overheid gereguleerde via het maag-darmkanaal, werden vervoerd over de bloed hersenen barrière3. Deze auteurs uitgevoerd volgens de methode van de gauvage beschreven door Collymore et al. intubatie 4 met enkele wijzigingen. Echter, deed ze niet het leveren van een zeer gedetailleerd protocol met een beschrijving van de procedure mondeling intubatie. Hier presenteren we een methode voor mondelinge intubatie van volwassen zebrafish Collymore et al. kapitaliseren 4 verder ook de voorbereiding van de darm voor relevante stroomafwaartse analyse door cytometry, confocal microscopie en qPCR.
De darm en met name de mucosa is de eerste lijn van verdediging tegen infectie en de primaire site voor opname van voedingsstoffen5. Wanneer de epitheliale cellen en cellen antigeen-presenteren binnen de mucosal belemmeringen gevaar signalen waarnemen, wordt een onmiddellijke ingeboren immune reactie geactiveerd. De zeer specifieke adaptieve immuunrespons wordt vervolgens vastgesteld door T en B lymfocyten6,7. Ontwikkeling van mondelinge vaccins is een huidige aandachtspunt in vaccintechnologie. Dergelijke vaccins zou een effectief instrument ter bescherming van het organisme op blootgestelde plaatsen als gevolg van de specifieke reactie van immuuncellen in de mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsels (mout)8,9. In de aquacultuur hebben mucosal vaccins duidelijke voordelen ten opzichte van injecteerbare vaccins. Ze zijn praktisch voor massale vaccinatie, minder arbeidsintensief, zijn minder belastend voor de vis, en aan jonge vis kunnen worden toegediend. Toch moeten de mucosal vaccin kandidaten het tweede segment van de darm zonder wordt gedenatureerd in de mondelinge omgeving bereiken. Zij moeten ook Kruis mucosal belemmeringen om toegang aan antigeen presentatie van cellen (APCs) voor het opwekken van de lokale en/of systemische reacties10te krijgen. Vandaar, testen van de mucosal opname bereikt door kandidaat-mondelinge antigenen en hun levering systemen, evenals de immune reactie opgeroepen, is essentieel bij de ontwikkeling van mondelinge vaccins.
In een biomedisch kader, ontwikkeling van een model om te testen van de biologische effecten van verbindingen na orale intubatie van groeiende belangstelling is. Veel van de anatomische en fysiologische functies van de darm worden bewaard tussen bilaterian geslachten, met zoogdieren en beenvissen11. Dit model van de mondelinge intubatie verbonden met stroomafwaartse analyse kan een hulpmiddel om inzicht in de menselijke biologie, evenals een proefterrein voor biologics of andere verbindingen in vivo.
Het mondelinge intubatie protocol kan worden uitgevoerd door een exploitant, bijvoorbeeldsuccesvol beheer van maximaal 50 µL van het eiwit nanoparticle schorsing wegende 1 g, met een hoog overlevingspercentage te vissen. De procedure is eenvoudig op te zetten en snel; 30 vis kan worden intubated in 1 h. Het protocol voor de voorbereiding van de darm is de sleutel tot het verstrekken van kwaliteit cel- en weefseltransplantaties monsters voor latere analyse. Voorbeelden van downstream resultaten worden gegeven waaruit blijkt dat het protocol van nut bij het verkrijgen van gegevens met betrekking tot intestinale opname en in het isoleren van kwaliteit RNA voor qPCR. Het protocol zou van groot nut zijn voor degenen die een geschikt model voor het testen van de dynamiek van mondelinge mondhygiëne of andere verbindingen in de darm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is een verbetering ten opzichte van de eerder beschreven techniek voor mondelinge intubatie door Collymore et al. 4 ons protocol beschrijft in detail de mondelinge intubatie methode en omvat de voorbereiding van de darm voor downstream analyses. Onze methode verbetert vis manipulatie snelheid waardoor één persoon uit te voeren van het hele protocol snel, zonder veel variatie tussen exploitanten. Een belangrijkste verschil van onze protocol met het vorige voorbeeld is dat we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van het Spaanse ministerie van wetenschap, de Europese Commissie en AGAUR fondsen NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER en 2014SGR-345-AGAUR). RT houdt een-gepromoveerde beurs van AGAUR (Spanje), JJ werd ondersteund door een PhD fellowship van de China Scholarship Raad (China) en NR wordt ondersteund door het programma Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Wij danken Dr. Torrealba voor deskundig advies bij de productie van eiwitten, N. Barba uit de “Servei de Microscopia” en Dr. M. Costa uit de “Servei de Citometria” van de Universitat Autònoma de Barcelona voor nuttige technische bijstand.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
- Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
- Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
- Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
- Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
- Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
- Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
- Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
- Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
- Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
- . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
- Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).
