不同二硫 Connectivities µ-芋螺毒素 PIIIA 异构体的合成与结构测定
Summary
富含半胱氨酸的肽折叠成不同的三维结构, 这取决于它们的二硫化物连通性。当缓冲氧化不导致所需的二硫化物连接时, 需要有针对性地合成单独的二硫化物异构体。该协议涉及 3-二硫键结合肽的选择性合成及其结构分析, 采用核磁共振和 ms/质谱研究。
Abstract
具有大量半胱氨酸的多肽通常受其二硫化物连通性对三维结构的影响。因此, 在肽合成过程中避免不必要的二硫化键形成是非常重要的, 因为它可能产生完全不同的肽结构, 从而改变生物活性。但是, 如果采用常规的缓冲氧化协议等标准自折叠方法, 可以形成多硫 connectivities 的正确形成。这个协议代表了一个先进的战略需要的目标合成多重二硫桥多肽, 不能合成通过缓冲氧化的高质量和数量。本研究展示了一种独特的保护基团策略, 用于合成µ-芋螺毒素 PIIIA 的所有可能的 3-二硫结合肽异构体。用 n-芴甲氧羰基基固相肽合成方法制备多肽, 采用保护基团策略确定二硫化物键形成。各自对半胱氨酸被保护与三苯甲氧基 (Trt), acetamidomethyl (Acm) 和叔丁基 (t步) 保护小组保证在每氧化步期间仅要求的半胱氨酸是 deprotected 和连接的。除了目标合成之外, 还使用几种分析方法来澄清所需肽结构的正确折叠和生成。对不同的 3-二硫化物粘结异构体的比较表明, 准确测定和认识二硫化物连通性对三维结构的计算和生物解释的重要性肽异构体的活性。分析表征包括通过串联质谱 (ms/毫秒) 分析精确的二硫化键说明, 这是由一个适应的协议产生的完整的肽异构体的部分减少和烷基化衍生物。此外, 用2D 核磁共振 (NMR) 实验和从 ms 和 ms 分析获得的知识来确定肽的结构。
Introduction
生物活性肽在药物研究和开发中的应用得到高度认可, 因为它们代表了特定生物靶1的有效和高度选择性化合物。然而, 对于它们的生物活性, 三维结构是非常重要的, 以执行结构-活动关系研究2,3,4。除影响整体构象的主要氨基酸序列外, 二硫键还能显著稳定半胱氨酸富肽5的结构。多重二硫化物桥接肽包括芋螺毒素, 如µ PIIIA圆锥 purpurascens , 其序列中含有六半胱氨酸。这种高半胱氨酸含量理论上允许形成15二硫化物异构体。正确的二硫化物连通性是非常重要的生物活动6,7。然而, 出现的问题是是否有一个以上的生物活性构象自然发生的肽, 如果是这样, 哪些异构体具有最高的生物活性？在µ-芋螺毒素的情况下, 生物靶点为电压门控钠离子通道, 特别是µ-PIIIA 对亚型 Nav1.2、nav1.4 和 nav1.73最有效。
采用多种方法可实现二硫桥多肽的合成。在肽内形成二硫化物键的最方便的方法是所谓的氧化自折叠法。在此, 首先用固相肽合成法合成所需循环肽的线性前体, 即在缓冲系统中由聚合物支持氧化后的裂解。氧化还原酶活性剂, 如还原和氧化谷胱甘肽 (GSH/GSSG) 往往增加, 以促进形成的二硫化物债券。缓冲支持自折叠的主要缺点是二硫化物债券不是以逐步的方式有选择地形成的。与原生肽相比, 通常只有一个特定的二硫化物异构体被描述, 有可能获得许多其他异构体以这个方法8。µ-PIIIA 已经被证明导致至少三种不同的折叠异构体后, 自折叠在以前的研究3。这种异构体混合物的分离是相当困难的, 由于相同的保留时间, 如果使用色谱纯化方法9。因此, 特定异构体的目标合成是有利的。为了专门生产具有定义的二硫化物连通性的异构体, 需要一个特殊的策略, 在其中二硫化物键连续关闭。因此, 在聚合物支持下合成了具有不同保护基团的线性前体在单个半胱氨酸对上。消除后, 半胱氨酸对分别和连续 deprotected 和连接在一个氧化反应, 以产生所期望的二硫化物债券10,11,12,13,14,15,16. 在反应产物的合成和纯化后, 需要用适当的分析方法确认识别和二硫化物的连通性。许多分析方法可用于阐明主要氨基酸序列, e., ms/毫秒, 而二硫化物连通性的测定仍然很少被调查。除了这种多重二硫化物粘结肽的复杂性外, 与产品相关的杂质 (例如, 从二硫化物上的), 由于样品的制备和工作, 可以进一步复杂化分析。在本文中, 我们表明, 使用不同的分析技术是必要的, 以明确澄清二硫化物键在µ-PIIIA 异构体的身份。我们将色谱方法与质谱相结合, 并提供了相同的样品到核磁共振光谱学中。在基质辅助激光解吸/电离 (MALDI) ms/质谱分析中, 我们用部分还原和 iodoacetamide 衍生的方法确定了二硫化物键, 因为这种肽的自顶向下分析是不可能的。为了获得每种异构体的三维结构, 进行了2D 核磁共振实验。因此, 通过结合不同的复杂的分析方法, 可以正确地阐明二硫化物连通性和三维结构复杂的多重二硫化物结肽7。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文描述的方法是合成富含半胱氨酸的多肽, 如µ-PIIIA, 是一种有选择地从同一氨基酸序列中产生二硫化物粘合异构体的可能性。因此, 建立了以 n-芴甲氧羰基为基础的固相肽合成18和确定的保护基团策略为选择性形成二硫化键的方法16。固相肽合成可以通过自动合成在聚合物支持 (树脂) 上产生氨基酸序列。这些氨基酸被保护免受不期望的副作用在序列装配期间由…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢 Resemann, 琼斯迈尔和 d. Suckau 从布鲁克 optics Daltonics 有限公司布里曼;d. 肋软骨炎、肋软骨炎、Schmidts 和 c. 达姆施塔特技术大学蒂勒;Ohlenschläger 从波恩大学 FLI 耶拿、Engeser m。Harzen, 和 h. Nakagami 来自最大的普朗克植物育种研究研究所, 科隆;Susanne Neupert 从动物研究所, 科隆;以及法兰克福大学的生物分子磁共振光谱学设施, 用于技术支持、培训模块和获取仪器。波恩大学向直喷的财政支助得到了感激的承认。
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
References
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