Summary

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Published: November 30, 2018
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Summary

Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.

Abstract

Consumo de oxigênio, prótons força (PMF) e vazamento de próton são medidas da respiração mitocondrial, ou quão bem as mitocôndrias são capazes de converter o NADH e DANIII em ATP. Desde que as mitocôndrias são também o local principal para o uso de oxigênio e nutriente oxidação de dióxido de carbono e água, quanto à eficácia, eles usam o oxigênio e produzem ATP diretamente se relaciona com a eficiência do metabolismo de nutrientes, as necessidades de nutrientes do animal, e saúde do animal. A finalidade desse método é examinar a respiração mitocondrial, que pode ser usada para examinar os efeitos das diferentes drogas, dietas e os efeitos ambientais sobre o metabolismo mitocondrial. Os resultados incluem o consumo de oxigênio, medido como respiração dependente de próton (estado 3) e respiração dependente do vazamento próton (estado 4). A relação da respiração estado 4 3 / estado é definida como índice de controlo respiratório (ICR) e pode representar a eficiência energética mitocondrial. Vazamento de próton mitocondrial é um processo que permite a dissipação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) desacoplamento fosforilação oxidativa do ADP, diminuindo a eficiência da síntese de ATP. Oxigênio e TRMP + eletrodos sensíveis com substratos mitocondriais e inibidores da cadeia de transporte de elétrons são usados para medir o estado 3 e 4 do estado respiração, membrana mitocondrial PMF (ou o potencial para produzir ATP) e vazamento de próton. Limitações para este método são que o tecido do fígado deve ser tão fresco quanto possível e todas as biópsias e ensaios devem ser realizados em menos de 10 h. Isso limita o número de amostras que podem ser recolhidos e tratados por uma única pessoa de um dia para aproximadamente 5. No entanto, é necessário apenas 1 g de tecido hepático, então em grandes animais, como gado leiteiro, a quantidade de amostra necessária é pequena em relação ao tamanho do fígado e há pouco tempo de recuperação necessário.

Introduction

As mitocôndrias são muito sensíveis ao estresse e seu ambiente celular pode contribuir para uma ampla variedade de doenças metabólicas. Consumo de oxigênio e vazamento de prótons na mitocôndria são indicadores de saúde de mitocôndrias. Os métodos descritos neste papel estimativa mitocondrial eficiência de energia usando RCR baseiam no consumo de oxigênio, com e sem vazamento de próton. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes1. Mudanças no consumo e próton vazamento de oxigênio podem identificar a disfunção mitocondrial, o que contribui para doenças metabólicas e resulta em eficiência energética diminuída. Esses métodos também podem ser usados para examinar o efeito de diferentes tratamentos na respiração mitocondrial. O objectivo geral de medição de consumo de oxigênio mitocondrial e cinética de vazamento de próton é para avaliar a função mitocondrial e eficiência energética.

Disfunção mitocondrial hepática tem sido associada com várias doenças no gado leiteiro. A capacidade do metabolismo celular para alternar entre combustíveis carboidrato e lipídios quando confrontados com um déficit de energia no início da lactação é influenciada pelo número e função da mitocôndria na célula2. Defeitos na capacidade das mitocôndrias de adaptar-se a um aumento da demanda de energia e aumento da β-oxidação podem levar ao acúmulo de lipídios intracelulares associados com resistência à insulina e podem levar à formação de esteatose hepática em vacas leiteiras de início da lactação. Mitocôndrias, como local de produção do corpo de cetona e uso, podem desempenhar um papel chave em cetose em vacas leiteiras3. Falta de mitocôndrias ou disfunção mitocondrial afetará a disponibilidade de combustível para a periferia e reflectir-se em mudanças no consumo de oxigênio ou RCR.

Alterações de consumo de oxigênio mitocondrial em resposta à inflamação. Sete dias de idade frangos foram aleatoriamente a um grupo de infectados com maxima de Eimeria e um grupo de controle4. Frangos de corte que não sofreu desafio de coccidiose tinham menor consumo de oxigênio devido ao vazamento de próton e RCR superior indicando que mitocôndrias hepáticas respondem a um desafio imune por crescente fuga de próton. Durante a fuga de próton e reativa produção de espécies de oxigênio foi considerada um sinal de disfunção da membrana mitocondrial e prejudicial para a eficiência energética, agora sabe-se que é importante para a importação de proteínas e cálcio em mitocôndrias5 e para a geração de calor1.

Vazamento de elétrons da cadeia respiratória faz mitocôndrias suscetíveis à produção de espécies reativas de oxigênio e danos oxidativos às proteínas da membrana mitocondrial, lipídios e DNA mitocondrial. Como idade de mitocôndrias, dano pode acumular-se especialmente ao DNA mitocondrial, causando mais de disfunção no metabolismo mitocondrial6 e maior suscetibilidade da vaca a doença. Na prática, muitos animais de pecuária são alimentados com altos níveis de suplementos tais como Cu, Zn e Mn para impulsionar a função antioxidante. No entanto, alimentando a altos níveis de Cu, Zn e Mn diminuição da produção de leite e aumentaram do consumo de oxigênio devido a próton vazamento (respiração estado 4)7.

Pesquisas anteriores sobre o papel da função mitocondrial em eficiência energética em gado centrou-se sobre as mudanças no consumo de oxigênio mitocondrial e vazamento de próton. Poucos estudos foram publicados no gado leiteiro e a maioria dos jornais comparam a eficiência de produção sob a forma de consumo de ração residual (RFI) para a função mitocondrial em bovinos de corte. Variabilidade na respiração mitocondrial taxas foram examinadas através da medição o estado 3, estado 4 e RCR em fígados de carne de vaca em lactação e vacas em lactação de Holstein vacas (Angus, Brangus e Hereford)8. Os pesquisadores não encontrou qualquer correlação na respiração mitocondrial com crescimento ou ordenha traços dos bovinos, mas fizeram relatório uma correlação entre a respiração mitocondrial e traços para Holsteins de ordenha. Em dois estudos, RFI foi comparado em bovinos de corte para taxas de respiração mitocondrial (estado 3, estado 4 e RCR) no músculo mitocôndrias9,10. Taxas de respiração mitocondrial alterada em resposta a DMI e taxas baixas foram associadas com novilhos de carne menos eficientes. Em outro estudo, RFI de novilhos de touros de alta ou baixos RFI foram comparados com as taxas de respiração mitocondrial e cinética de vazamento de protões entre os dois grupos de descendência11. As diferenças foram devido ao ganho confirmando a conclusão de que a ganhar faz não respiração mitocondrial impacto em bovinos de corte.

Neste trabalho, um experimento para examinar o fígado RCR em resposta à alimentação 3 minerais antioxidante para gado de leite em lactação ilustra o uso de métodos para medir consumo de oxigênio durante 4 do estado e estado 3 respiração e PMF.

Protocol

Todos os métodos, protocolo e estudos aqui descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis. 1. a obtenção de uma biópsia do fígado de uma vaca leiteira de Holstein Nota: Uma biópsia do fígado deve ser realizada por um veterinário licenciado. Biópsias do fígado podem ser executadas no site onde se situam as vacas leiteiro. Vacas leiteiras em lactação podem continuar a s…

Representative Results

Resultados positivos, mostrando a cinética de vazamento RCR e prótons são mostrados na tabela 1 e Figura 15, respectivamente. No presente estudo7, RCR e proteína vazamento cinética foram medidos em vacas leiteiras Holstein em 70 dias no leite depois que as vacas tinham sido alimentadas 1 dos 5 níveis diferentes de Cu, Zn e Mn por 28 dias. Estado 4, respiração de vazamento-dependente de próton máximo, tinha um…

Discussion

O ponto mais crítico no protocolo é obter uma amostra representativa de tecido hepático e começando o isolamento da mitocôndria, logo que possível após a biópsia. Variação nas medições de respiração é baixa (tabela 1) devido a um tempo de transporte curto de vaca para laboratório. Para reduzir o tempo de transporte, foi instituído um pequeno laboratório no escritório da leiteria, e amostras de fígado foram levadas para o laboratório de escritório como cada uma foi coletada para que …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pela Alltech e USDA Hatch fundos através do centro de Sanidade Animal de comida na UC Davis School de medicina veterinária.

Materials

Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma – Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma – Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4×4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma – Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma – Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma – Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma – Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma – Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma – Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma – Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma – Aldrich 38796
Hepes Sigma – Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma – Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma – Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma – Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma – Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma – Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma – Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma – Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma – Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma – Aldrich 75351
FCCP Sigma – Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma – Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma – Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma – Aldrich N7143
FCCP Sigma – Aldrich C3920
TPMP Sigma – Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

References

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Cite This Article
Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

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