Måling af leveren mitokondrie iltforbrug og Proton lækage kinetik for at anslå mitokondrie Respiration i Holsten malkekvæg

Summary

Her deler vi metoder til måling af mitokondrie iltforbrug, et definerende begrebet ernæringsmæssige energetik og proton lækage, den primære årsag til ineffektivitet i mitokondrie generation af ATP. Disse resultater kan udgøre 30% af den energi tabt i næringsstofudnyttelse til at hjælpe med at evaluere mitokondrie funktion.

Abstract

Forbrug af ilt, proton motiv tvinge (PMF) og proton lækage er målinger af mitokondrie respiration, eller hvor godt mitokondrier er købedygtig omforme NADH og FADH i ATP. Da mitokondrier er også den primære lokalitet for oxygen brug og næringsstof oxidation til CO2 og vand, hvor effektivt de bruger ilt og producerer ATP direkte vedrører effektiviteten af næringsstof metabolisme, næringsstofbehov af dyret, og sundhed af dyret. Formålet med denne metode er at undersøge mitokondrie respiration, som kan bruges til at undersøge virkningerne af forskellige stoffer, kostvaner og miljømæssige effekter på mitokondrie stofskifte. Resultaterne omfatter iltforbrug målt som proton afhængige respiration (tilstand 3) og proton lækage afhængige respiration (status 4). Forholdet mellem staten 3 / stat 4 respiration er defineret som luftvejskontrol ratio (RCR) og kan repræsentere mitokondrie energiske effektivitet. Mitokondrie proton lækage er en proces, der giver mulighed for spredning af mitokondrielle membran potentiale (MMP) ved frakobling oxidativ fosforylering af ADP faldende effektiviteten i ATPsyntesen. Ilt og TRMP + følsomme elektroder med mitokondrie substrater og elektron transport kæde hæmmere anvendes til at måle tilstand 3 og staten 4 respiration, mitokondrielle membran PMF (eller potentiale til at producere ATP) og proton lækage. Begrænsninger til denne metode er at leveren væv skal være så frisk som muligt og alle biopsier og assays skal udføres i mindre end 10 h. Dette begrænser antallet af prøver, der kan indsamles og behandles af en enkelt person i en dag til ca 5. Dog er kun 1 g af levervævet nødvendige, så i store dyr, som malkekvæg, mængden af prøven nødvendige er lille i forhold til leveren størrelse og der er lidt restitutionstid behov.

Introduction

Mitokondrier er meget følsomme over for stress og deres cellulære miljø kan bidrage til en bred vifte af metaboliske sygdomme. Forbrug af ilt og proton lækage i mitokondrier er indikatorer for mitokondrier sundhed. De beskrevne i dette papir skøn mitokondriets energieffektivitet ved hjælp af RCR metoder baseret på iltforbrug med og uden proton lækage. Disse resultater kan udgøre 30% af den energi tabt i næringsstofudnyttelse¹. Ændringer i ilt forbrug og proton lækage kan identificere mitokondriel dysfunktion, som bidrager til metabolisk sygdom og resulterer i nedsat energieffektivitet. Disse metoder kan også bruges til at undersøge effekten af forskellige behandlinger på mitokondrie respiration. Det overordnede mål for måling af mitokondrie iltforbrug og proton lækage kinetik er at evaluere mitokondrie-funktion og energiske effektivitet.

Nedsat mitokondriel dysfunktion har været forbundet med flere sygdomme i malkekvæg. Cellulære metabolisme evne til at skifte mellem kulhydrat og lipid brændstoffer når de står med et energi underskud i tidlig laktation er påvirket af den nummer og funktion af mitochondrier i cellen². Defekter i mitokondrierne evne til at tilpasse sig til en øget efterspørgsel efter energi og øget β-oxidation kan føre til ophobning af intracellulære lipid associeret med insulinresistens og kan føre til dannelse af fedtlever i tidlig laktation malkekøer. Mitokondrierne, kan som stedet for keton organ produktion og anvendelse, spille en nøglerolle i ketosis i malkekøer³. Manglende mitokondrier eller mitokondriel dysfunktion vil påvirke brændstof tilgængelighed til periferien og afspejles i ændringer i forbrug af ilt eller RCR.

Mitokondrie ilt forbrug ændringer som reaktion på betændelse. Syv dage gamle slagtekyllinger blev tilfældigt tildelt en gruppe, der er inficeret med Eimeria maxima og en kontrol gruppe⁴. Slagtekyllinger, der ikke undergår coccidiose udfordring havde lavere forbrug af ilt på grund af proton lækage og højere RCR med angivelse af at leveren mitokondrier reagere på en immun udfordring ved stigende proton lækage. Mens proton lækage og reaktive ilt arter produktion blev engang betragtet som et tegn på mitokondrielle membran dysfunktion og skadelig for energiske effektivitet, nu det er kendt at det er vigtigt for import af proteiner og calcium til mitokondrier⁵ , og for generation af varme¹.

Elektron lækage fra respiratorisk kæden gør mitokondrier modtagelige for reaktive ilt arter produktion og oxidative skader til mitokondrielle Membranproteiner, lipider og mitokondrie-DNA. Som mitokondrier alder, skaden kan ophobes især til mtDNA forårsager yderligere dysfunktion i mitokondrie stofskifte⁶ og større modtagelighed af koen til sygdom. I praksis, er mange dyr dyr fodret høje niveauer af kosttilskud såsom Cu, Zn og Mn at øge antioxidant funktion. Men fodring høje niveauer af Cu, Zn og Mn faldt mælkeproduktion og øget iltforbrug på grund af proton lækage (State 4 respiration)⁷.

Tidligere forskning på rollen mitokondriel funktion i energieffektivitet i kvæg har fokuseret på ændringer i mitokondrie iltforbrug og proton lækage. Meget få undersøgelser er blevet offentliggjort i malkekvæg og de fleste papirer sammenligne produktionseffektivitet i form af resterende foderoptagelse (RFI) til mitokondrie-funktion kødkvæg. Variation i mitokondrie respiration satser blev undersøgt ved måling tilstand 3, stat 4 og RCR i lever fra både ammende Holstein køer og ammende oksekød køer (Angus og Hereford, Brangus)⁸. Forskerne fandt ikke nogen korrelation i mitokondrie respiration med vækst eller malkning træk for kødkvæg men rapport en korrelation mellem mitokondriel respiration og malkning træk for Holstein. I to undersøgelser, blev RFI sammenlignet i kødkvæg til mitokondrie respiration satser (tilstand 3, stat 4 og RCR) i muskel mitokondrier^9,10. Mitokondrie respiration satser ændret svar på DMI og lave priser var forbundet med mindre effektive oksekød stude. I en anden undersøgelse, RFI af stude fra højt eller lavt RFI tyre blev sammenlignet med mitokondrie respiration satser og proton lækage kinetik mellem de to grupper af afkom¹¹. Forskellene skyldtes gevinst bekræfter den konklusion, at få gør ikke virkning mitokondrie respiration i kødkvæg.

I dette papir, et eksperiment undersøger leveren RCR svar på fodring 3 antioxidant mineraler til ammende malkekvæg illustrerer brugen af metoder til at måle iltforbruget under State 4 og 3 respiration og PMF.

Protocol

Alle metoder, protokol og undersøgelser beskrevet her blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) fra University of California, Davis. 1. at opnå en leverbiopsi fra Holsten malkeko Bemærk: En leverbiopsi bør udføres af en autoriseret dyrlæge. Leveren biopsier kan udføres på webstedet mejeri hvor køerne er placeret. Ammende malkekøer kan fortsætte med at blive malket normalt og mælk skal ikke trækkes fra fødevareforsyning før elle…

Representative Results

Positive resultater viser RCR og proton lækage kinetik er vist i tabel 1 og Figur 15, henholdsvis. I denne undersøgelse7, RCR og protein lækage blev kinetik målt i Holsten malkekøer på 70 dage i mælk efter køer havde fået 1 af 5 forskellige niveauer af Cu, Zn og Mn i 28 dage. Staten 4, maksimale proton lækage-afhængige respiration, havde en tendens til at blive påvirket af mineral indtagelse af Cu, Mn og Zn…

Discussion

Det mest kritiske punkt i protokollen at opnå en repræsentativ lever vævsprøve og begynder isolering af mitokondrier hurtigst muligt efter biopsi. Variation i respiration målinger er lavt (tabel 1) på grund af en kort transporttid fra ko til laboratorium. For at reducere transporttiden, en lille laboratorium blev oprettet i office af mejeriet, og leveren prøver blev kørt til office laboratorium, som hver blev indsamlet, således at mitokondrier var isoleret inden for 10 min af biopsi. Opsætning …

Materials

Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Suture	Fisher Scientific	19-037-516
Suture needles	NA	NA	Included with Suture
Scalpels	Sigma – Aldrich	S2896 / S2646	# for handle and blades
Surgery towels	Fisher Scientific	50-129-6667
Falcon tubes 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Tweezers	Sigma – Aldrich	Z168750
50 mL syringes	Fisher Scientific	22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Cow halter	Tractor Supply Co.	101966599
Cotton swabbing	Fisher Scientific	14-959-102
cotton gauze squares (4×4)	Fisher Scientific	22-246069
Medical scissors	Sigma – Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow			Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine			Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days			Provided by Veterinarian
Providone Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Ethanol 70%	Sigma – Aldrich	793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight			Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)			Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine			Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance	Fisher Scientific	02-911-527
Homogenizer Motor	Cole Parmer	EW-04369-10
Homogenizer Probe	Cole Parmer	EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice	Fisher Scientific	FB100600
Refrigerated microfuge	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)	abcam	ab102536
Sucrose	Sigma – Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma – Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma – Aldrich	EDS-1KG
BSA (fatty acid free)	Sigma – Aldrich	A7030-50G
Mannitol	Sigma – Aldrich	M4125-1KG
Deionized water	Sigma – Aldrich	38796
Hepes	Sigma – Aldrich	H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode	Hansatech (PP Systems)	OXY1
Thermoregulated Water Pump	ADInstruments	MLE2001
Clark type Oxygen electrode	NA	NA
Autopipette (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Included with Oxy1
Small magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-95
Micropipette (10 μL)	Cole Parmer	SK-21600-60
pH meter	VWR
Chemicals
KCl	Sigma – Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma – Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma – Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma – Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma – Aldrich	E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)	Sigma – Aldrich	R8875-5G
Succinate (1 M solution)	Sigma – Aldrich	S3674-250G
ADP (100 mM solution)	Sigma – Aldrich	A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)	Sigma – Aldrich	75351
FCCP	Sigma – Aldrich	C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)	Sigma – Aldrich	M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma – Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma – Aldrich	N7143
FCCP	Sigma – Aldrich	C3920
TPMP	Sigma – Aldrich	T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA