Extracellular ट्रिपनोसोम का शुद्धिकरण, अफ्रीकी सहित, द्वारा रक्त से Anion-एक्सचेंजर्स (Diethylaminoethyl-सेलुलोस कॉलम)
Summary
रक्त से trypanosome जुदाई की इस विधि उनकी सतह चार्ज पर निर्भर करता है स्तनधारी रक्त कोशिकाओं से कम नकारात्मक जा रहा है । संक्रमित रक्त रखा जाता है और एक anion-एक्सचेंजर कॉलम पर इलाज किया । इस विधि, अफ्रीकी trypanosomiasis के लिए सबसे फिटिंग नैदानिक, immunological, जैविक, जैव रासायनिक, दवा और आणविक जीव विज्ञान की जांच के लिए शुद्ध परजीवी प्रदान करता है ।
Abstract
इस विधि trypanosomes के पृथक्करण की अनुमति देता है, परजीवी जानवर और मानव अफ्रीकी trypanosomiasis के लिए जिंमेदार (टोपी), संक्रमित रक्त से । यह पहले चरण टोपी के निदान के लिए सबसे अच्छा तरीका है और इसके अलावा इस परजीवी शोधन विधि सीरम वैज्ञानिक और अनुसंधान जांच परमिट ।
हैट की वजह से होता है सीटसे फ्लाई ट्रांसमिट ट्रिपनोसोमा ब्रुआफॅ गैंबिएनसे और टी. बी. रोडीसींस । संबंधित ट्रिपनोसोम, पशु ट्रिपनिसोमिआसिस के रोगजनक कारक हैं । ट्रिपैनोकुछ जांच हाच निदान, उपचार और अनुवर्ती के लिए आवश्यक है । यहां वर्णित तकनीक सबसे संवेदनशील परजीवी जांच तकनीक है, जो टी. बी. गैंबींस हैट के निदान के लिए क्षेत्र की स्थितियों के अनुकूल है और इसे एक घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है । रक्त एक anion पर स्तरित है-एक्सचेंजर कॉलम (डीएए सेलुलोस) पहले से 8 पीएच को समायोजित, और रेफरेंस बफर जोड़ा जाता है । अत्यधिक ऋणात्मक आवेशित रक्त कोशिकाएँ स्तंभ पर अधिशोषित होती हैं जबकि कम ऋणात्मक प्रभारित ट्रिपनोसोम के माध्यम से गुजरती हैं । एकत्रित ट्रिपनोसोम अपकेंद्रण द्वारा पेल्टेड होते हैं और माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है । इसके अलावा, परजीवी सेलुलर नुकसान के बिना तैयार कर रहे है whilst उनके infectivity बनाए रखने ।
शुद्धि ट्रिपनोसोम प्रतिरक्षा परीक्षण के लिए आवश्यक हैं; वे trypanolysis परख, टोपी serology में सोने के मानक में उपयोग किया जाता है । दाग परजीवी क्षेत्र serology के लिए कार्ड समूहन परीक्षण (catt) में उपयोग किया जाता है । प्यूरेफाइड ट्रिपनोसोम से एंटीजन, जैसे भिन् न पृष् ठ ग्लाइकोप्रोटीन, बहिर्वेतिजन, विभिन् न प्रतिरक्षा में भी प्रयोग किए जाते हैं यहां वर्णित प्रक्रिया अफ्रीकी trypanosomes के लिए बनाया गया है; नतीजतन, क्रोमैटोग्राफी शर्तों प्रत्येक trypanosome तनाव के लिए अनुकूलित किया जाना है, और अधिक आम तौर पर, मेजबान स्तनपायी की प्रत्येक प्रजाति के रक्त के लिए ।
इन आकर्षक रोगजनकों आसानी से शुद्ध और biochemical में उपयोग करने के लिए उपलब्ध हैं, आणविक और कोशिका जीवविज्ञान मेजबान कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति सहित अध्ययन करने के लिए मेजबान की जांच करने के लिए झिल्ली रिसेप्टर्स के स्तर पर परजीवी रिश्तों, संकेतन, और जीन अभिव्यक्ति विट्रो मेंदवा परीक्षण; जीन विलोपन, उत्परिवर्तन, या चयापचय की प्रक्रिया पर overexpression, cytoकंकाल जीवजनन और परजीवी अस्तित्व की जांच ।
Introduction
प्रस्तुत विधि यहां वर्णित trypanosomes के पृथक्करण की अनुमति देता है, परजीवी जानवर और मानव के लिए जिंमेदार अफ्रीकी trypanosomiasis (टोपी), रक्त से । यह पहले चरण टोपी के निदान के लिए सबसे अच्छा तरीका है और इसके अलावा इस परजीवी शोधन विधि मजबूत सीरम विज्ञानी और अनुसंधान जांच परमिट ।
हैट की वजह से होता है सीटसे फ्लाई ट्रांसमिट ट्रिपनोसोमा ब्रुआफॅ गैंबिएनसे और टी. बी. रोडीसेंस1. ये प्रोटोजोआन परजीवी रोग के पहले चरण (hemलसीका चरण) के दौरान खून, लसीका, और अंतरालीय तरल पदार्थ में extracellularly गुणा । दूसरे चरण (meningoencephalitic अवस्था) जब परजीवी रक्त मस्तिष्क बाधा पार शुरू होता है; एक नींद विकार है, जो अपने नाम “सो बीमारी” इस रोग के लिए दिया गया है सहित स्नायविक लक्षण, इस दूसरे चरण2की विशिष्ट हैं । संबंधित ट्रिपनोसोम (टी. एवंसी, टी. congolense, टी. विवैक्स, टी. बी. ब्रुआफॅ), पशु अफ्रीकन ट्रिपान्सोमोसिस (AAT)3के प्रेरणा कारक हैं ।
विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) २०२० द्वारा एक सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या के रूप में टोपी को खत्म करने और २०३०4द्वारा संचरण रोकने के लिए करना है । तेजी से निदान परीक्षणों के हाल ही में परिचय सीरम विज्ञानी निदान1,4,5में सुधार हुआ है । कई आण्विक नैदानिक परीक्षणों को विकसित किया गया है लेकिन क्षेत्र निदान में उनकी भूमिका अभी तक स्थापित नहीं की गई है5। वे ब्रूआफॅ समूह और atypical ट्रिपनोसोमिआसिस की उप प्रजातियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है परजीवी के लिए जिंमेदार के कारण जानवरों trypanosomosis6।
परजीवी का पता लगाने के निदान, उपचार और अनुवर्ती के लिए आवश्यक है, के रूप में सीरोलॉजी झूठी सकारात्मक और दुर्भाग्य से झूठी नकारात्मक परिणाम1दे सकते हैं । टी. बी. गैंबिएंसके कारण होने वाले हैट मामलों में, (मामलों की ९५% से अधिक) कम परजीवी के रूप में नियम हैं, जबकि टी. बी. rhoडीजींसकी वजह से टोपी के लिए, एक बड़ी है इन hemoflagellate प्रोटिस्टों की प्रत्यक्ष सूक्ष्मदर्शीय अवलोकन मुश्किल है रक्त में परजीवी की संख्या अक्सर मौजूद होते हैं । विभिंन एकाग्रता तकनीकों का इस्तेमाल किया गया है, जैसे मोटी बूंद और केशिका ट्यूब केंद्रापसारक (सीटीसी), लेकिन anion के एक कॉलम द्वारा रक्त से परजीवी के पृथक्करण-एक्सचेंजर (डीएए सेलुलोस) केंद्रापसारक और सूक्ष्मदर्शी अवलोकन के बाद गोली, सबसे संवेदनशील विधि है (लगभग ५० परजीवी/एमएल रक्त का पता लगाया जा सकता है)1,7. फलस्वरूप, इस anion द्वारा trypanosomes की शुद्धि-एक्सचेंजर्स (डीएए सेलुलोस) विधि सबसे अच्छा है और, तारीख करने के लिए, visualizing और टोपी निदान के लिए खून से परजीवी अलग करने के लिए संदर्भ विधि । क्षेत्रीय परिस्थितियों में, डीएएई सेलुलोस का एक लघु कॉलम सफलतापूर्वक प्रयोग किया गया है और कई सुधार माइक्रोस्कोकल प्रेक्षण7,8में मदद कर चुके हैं ।
रक्त से trypanosome जुदाई की विधि, नीचे वर्णित, परजीवी सतह चार्ज है, जो कम नकारात्मक है पर निर्भर करता है स्तनधारी रक्त कोशिकाओं9। दिलचस्प है, इस विधि ५० साल पहले विकसित किया गया था, १९६८ में Dr. शीला Lanham द्वारा, और पता लगाने और खून trypanosomes की तैयारी के लिए सोने के मानक बनी हुई है । यह तेजी से है और स्तनधारियों की एक विस्तृत श्रृंखला से लार trypanosomes के लिए reproducible, दोनों जानवर और मानव trypanosomiasis के निदान की अनुमति10।
जीवित प्राप्त करने के लिए, शुद्ध परजीवी, संक्रमित रक्त एक anion-एक्सचेंजर कॉलम पर जोड़ा जाता है । Chromatography शर्तों (मुख्य रूप से पीएच, बफ़र्स की आयनिक शक्ति/मीडिया) प्रत्येक trypanosome प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जाना है, और अधिक आम तौर पर, स्तनधारी रक्त कोशिकाओं के प्रत्येक मिश्रण करने के लिए और10trypanosome । Elution बफर ठीक सबसे अफ्रीकी trypanosomes10के लिए पीएच 8 को समायोजित किया है । इस विधि से रोगियों के रक्त में पाए जाने वाले परजीवी की एकाग्रता का उपकार होता है, क्योंकि पैरासेमियस को भी सूक्ष्मदर्शी प्रेक्षण द्वारा ही पता लगाया जा सकता है, और यह प्रयोगशाला जांच को भी सक्षम बनाता है । ताजा अलग trypanosomes के साथ काम करने और संक्रमित पशुओं से खून पर, इस तकनीक का उपयोग कर, परजीवी है कि एक अनिश्चित अवधि के लिए प्रयोगशाला में असंदूषित स्थितियों में किया गया है के साथ अध्ययन से विभिंन जांच के लिए और अधिक प्रासंगिक है ।
मेजबान-परजीवी संबंधों को सबसे अच्छा एक अपने प्राकृतिक मेजबान को संक्रमित परजीवी के साथ अध्ययन कर रहे हैं, इसलिए, टी musculi, एक प्राकृतिक म्यूरिन परजीवी, जो extracellular trypanosomes के प्रतिनिधि है, murine संक्रमण के रूप में कई फायदे है एक में शामिल है लघु प्रयोगशाला पशु और जैव जोखिम सुरक्षा स्तर (बीएसएल) की स्थिति की आवश्यकता नहीं है । टी musculi असुरक्षित चूहों को मारने नहीं है, मानव रोगजनकों सहित कई अन्य trypanosoma प्रजातियों के विपरीत । T. musculi टी सेल में समाप्त नहीं कर रहे हैं-वंचित चूहों और परजीवी भोजन और पोषक तत्वों का सेवन11संशोधित करके संक्रमित चूहों में बढ़ाया जा सकता है. यह परजीवी अन्य रोगजनकों12के साथ सह-संक्रमणों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया modulates. T . musculi संक्रमित चूहों से सुसंस्कृत टी musculi से मतभेद प्रदर्शन, उदाहरण के लिए, झिल्ली एफसी रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति टी में खो जाता है musculi असंदूषित संस्कृतियों, संक्रमित चूहों से शुद्ध परजीवी की तुलना में13 , 14. उत्सर्जित-स्रावित कारकों (esf) भी गुणात्मक और मात्रात्मक कम एक्जेनिक trypanosome संस्कृतियों में व्यक्त कर रहे है और स्थानिकमारी वाले क्षेत्रों में अलग उपभेदों के बीच अलग15। ESF पहली एंटीजन मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रदर्शित करने के लिए कर रहे है और इसलिए प्रारंभिक मेजबान प्रतिरक्षा16प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ।
प्रायोगिक रूप से संक्रमित पशुओं में प्रयोगशाला जांच के लिए, इस प्रोटोकॉल परजीवी की एक बड़ी संख्या पर प्रयोग की सुविधा, विशेष रूप से जब immunosuppressed जानवरों का उपयोग कर आवश्यक चूहों की संख्या को कम करने । बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग में ट्रिपनोसोमिएसिस (CATT) के लिए कार्ड Agglutination परीक्षण में उपयोग किया जाता है कि संस्करण सतह नच (VSGs) अभी भी trypanosomes है कि चूहों में प्रचारित कर रहे हैं से शुद्ध कर रहे हैं । दो तेजी से नैदानिक परीक्षणों (व्यक्तिगत कैसेट लिपटे) है कि क्षेत्र में उपयोग के लिए अब उपलब्ध हैं, अभी भी देशी vsgs के एक संक्रामक मॉडल स्रोत का उपयोग कर रहे है और नहीं विट्रो में सुसंस्कृत trypanosomes1,4, 5. trypanosome प्रतिरक्षा विज्ञान और जीव विज्ञान के अध्ययन में प्रगति की सुविधा के बाद से इन डीईए सेलुलोस शुद्ध परजीवी आसानी से प्राकृतिक रूप से या प्रयोगात्मक संक्रमित मेजबान से बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है, और विशेष रूप से, rodents ।
Protocol
Representative Results
Discussion
शुद्ध trypanosomes प्रतिरक्षा विज्ञान, जैव रसायन, सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं । डेटा और परिणामों के बड़े विस्तार trypanosomes से प्राप्त किया गया है, जो …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम UMR के सभी सदस्यों को धंयवाद १७७ INTERTRYP IRD CIRAD विश्विद्यालय डे बोर्डो । इस शोध के बोर्डो और समर्थन से विश्वविद्यालय से आंतरिक धन द्वारा समर्थित किया गया था और ANR, LABEX परफरप ANR से-11-LABX-0024, और एसोसिएशन से डालो ले développement डे ला रीचेरचे एन पैराकोटोलोजी एट médecine tropicale और सेवा de coopération et d ‘ कार्रवाई cultuरिले de l ‘ एंबैसेड डी फ्रांस à बांगुई (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
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