陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製
Summary
トリパノソーマ血から分離のこの方法は、哺乳類の血液細胞よりも小さい負となりその表面電荷に依存します。感染した血は配置し、陰イオン交換カラムに扱われます。このメソッド、アフリカ睡眠病の最もフィッティング診断は、免疫学的、生物学的、生化学的、薬学・分子生物調査のため精製の寄生虫を提供します。
Abstract
このメソッドでは、trypanosomes、寄生虫感染した血液から動物と人間アフリカ トリパノソーマ症 (帽子)、責任の分離をことができます。これは第一段階の帽子の診断のための最善の方法とさらにこの寄生虫の浄化方法により、血清学的調査研究します。
帽子はツェツェ バエ送信トリパノソーマ原虫 gambienseによって引き起こされるとt. b. rhodesiense.関連 trypanosomes ナガナ病の病原であります。トリパノソーマの検出は、帽子の診断、治療、フォロー アップに不可欠です。ここで説明する手法はt. b. gambiense帽子の診断のための圃場条件に合わせ、最も敏感な寄生虫検出手法を 1 時間以内に完了することができます。血液は ph 8、以前調整陰イオン交換カラム (DEAE セルロース) に階層化され溶出バッファーが追加されます。少ない負荷電の trypanosomes を通過するのに対し、高負荷電の血液細胞が列に吸着しました。収集した trypanosomes は、遠心分離によってペレットし、顕微鏡で観察。また、寄生虫は感染性を維持しながら、細胞損傷せずに用意しています。
精製 trypanosomes、免疫学的検査に必要です彼らは、trypanolysis のアッセイ帽子血清のゴールド スタンダードで使用されます。ステンド グラスの寄生虫は、フィールド血清カード凝集反応 (CATT) で利用されています。Exoantigens、バリアント表面糖などの精製された trypanosomes からの抗原は様々 なイムノアッセイでも使用されます。ここで説明した手順は、アフリカトリパノソーマ;その結果、クロマトグラフィー条件は、それぞれの種のホストの哺乳類の血をトリパノソーマ菌株、およびもっと一般を合わせられなければなりません。
これらの病原体を魅力的な簡単に精製されで使用する生化学的な分子と細胞膜受容体、シグナル伝達、遺伝子のレベルでホスト寄生虫の関係を調査するための宿主細胞との共培養を含む生物学研究式です。薬物テスト体外;遺伝子の削除、突然変異、または代謝プロセス、細胞骨格の生合成および寄生虫生存に過剰発現の調査。
Introduction
手法説明ここで trypanosomes、寄生虫血から動物と人間アフリカ トリパノソーマ症 (帽子)、責任の分離を可能します。最初の段階の帽子の診断のための最善の方法で、さらにこの寄生虫の浄化方法により、堅牢な血清学の調査。
帽子はツェツェ バエ送信トリパノソーマ属 gambienseとt. b. rhodesiense1.によって引き起こされるこれらの原虫疾患 (hemolymphatic 展開ステージ) の最初の段階の間に、血流、リンパ、間質液細胞外を乗算します。第二期 (meningoencephalitic 期) 寄生虫クロス血液脳関門; ときに開始します。この病気はその名「睡眠病」を与えている、睡眠障害などの神経学的徴候はこの第 2 段階2の典型的であります。関連 trypanosomes (t. エバンシーいる、t. の vivax、t. b. グリコシルホスファチジルイノシトール) は、動物アフリカトリパノソーマ (AAT)3の病原です。
世界保健機関 (WHO) は、2020 年までに公衆衛生問題として帽子を排除して 20304伝送を停止するを目指します。迅速診断テストの最近の導入は、改善された血清学的診断1,4,5を持っています。いくつかの分子診断テストが開発されているが、フィールド診断におけるそれらの役割の確立5されていません。グリコシルホスファチジルイノシトールグループ、動物トリパノソ6担当の寄生虫によって引き起こされる非定型の治療法のサブ種を識別するために使用されます。
血清反応偽陽性と残念なことに偽陰性の結果1を与えることができる寄生虫の検出は診断・治療・ フォロー アップは欠かせません。これらの hemoflagellate の原生生物の直接顕微鏡観察によって引き起こされるt. b. gambiense、(95% 以上) 低 parasitemias ルールは、一方、 t. b. rhodesiense、大規模なによる帽子の帽子の場合はむずかしい寄生虫の数は頻繁に血の存在です。厚いドロップやキャピラリー チューブ遠心分離 (CTC) といった様々 な濃度の技術も使用されているが、寄生虫の陰イオン交換体 (DEAE セルロース) の列によって血液からの分離遠心分離して顕微鏡観察、ペレット、最も敏感な方法です (約 50 寄生虫/ミリリットルの血液を検出できる)1,7。その結果、この陰イオン交換器 (DEAE セルロース) 法による trypanosomes の浄化は最高とまでは、可視化および帽子の診断のための血液の寄生虫を分離するための参照方法。、フィールド条件で DEAE セルロースのミニ列が使用されています、いくつかの改善は、顕微鏡観察7、8を促進しました。
下記の血液からトリパノソーマ分離法は、寄生虫の表面電荷は、哺乳類の血液細胞9より小さい負に依存します。興味深いことに、このメソッドは、50 年前、博士シーラ ランハムによって 1968 年に開発された、検出と血流 trypanosomes の準備のためのゴールド スタンダードのまま。高速、両方の動物と人間のトリパノソーマ症10の診断を許可する哺乳類の広い範囲から salivarian trypanosomes の再現です。
生活、精製された寄生虫を得るためには、感染した血液が陰イオン交換カラムに追加されます。クロマトグラフィー条件 (主に pH、イオン強度のバッファー/メディア) は、哺乳類の血液細胞と trypanosomes10の各組み合わせに各トリパノソーマ種およびもっと一般を合わせられなければならないと。溶出バッファーは、ほとんどのアフリカの trypanosomes10の pH 8 に正確に調整されます。Parasitemias は単独で顕微鏡観察によって検出するのには低すぎるので、このメソッドが寄生、患者の血液中の濃度を優先し、検査することもできます。新鮮単離 trypanosomes とこのテクニックを使用して、感染した動物から血の上の作業は無期限研究室で無菌状態で培養されている寄生虫の研究よりも様々 な調査のより適切です。
宿主-寄生生物関係は最高、寄生虫、したがって、その自然なホストに感染するt. 筋、細胞外 trypanosomes の代表である、多くの利点は、マウスの感染に伴う自然マウス寄生虫に師事、実験小動物バイオハザード安全レベル (BSL) 条件を必要としません。T. 筋は人間の病原体を含む他の多くのトリパノソーマ種とは異なり、免疫マウスを殺さない。T. 筋がないマウスの T 細胞を奪われた排除され、食品や栄養素の摂取量の11を変更することにより感染したマウスの parasitemias を増やすことができます。この寄生虫は、12の他の病原体による共同感染の免疫応答を調節します。T. 筋培養t. 筋から感染したマウス展違いからたとえば、膜 Fc 受容体の発現t. 筋無菌共生栽培、感染マウス13から精製した寄生虫に比較で失われます,14. Excreted 分泌因子 (ESF) も定性的・定量的無菌トリパノソーマ文化小さい単位、流行地域15で分離された株の間で異なります。ESF は、宿主の免疫系に表示しのでの再生ホストの初期に重要な役割免疫応答16最初の抗原です。
実験室調査のための実験感染動物でこのプロトコルは寄生虫、特に免疫抑制動物を使用するときに必要なマウスの数を最小限に抑えることのより多くの実験を促進します。マス ・ スクリーニングのトリパノソーマ症 (CATT) のためにカード凝集テストで使用されるバリアント表面糖 (Vsg) はまだラットでは反映され trypanosomes から浄化されます。フィールドで使用可能な 2 つ迅速診断テスト (個別にラップされたカセット) はまだネイティブ Vsg およびない trypanosomesの in vitro培養1,ので4,の感染モデル ソースを使用して5. これら DEAE セルロースを精製した寄生虫は、特に齧歯動物、自然または実験的感染ホストから大量に簡単に取得できるので、トリパノソーマ免疫学と生物学の研究の進歩が促進されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
浄化された trypanosomes は、免疫学、生化学、細胞および分子生物学を研究するための強力な手段を表しています。データと結果の大きい広がりは他の真核細胞の30から情報を取得するために貢献してきましたし、trypanosomes から得られています。彼らは存続し、2 つの非常に異なる環境で育つことを可能にする多数のメカニズムを考案しているので trypanosomes がまた重要で興味?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たち UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD ユニヴェルシテ ・ ド ・ ボルドーのすべてのメンバーに感謝します。この研究は、ボルドー大学から内部の資金によって支えられた、サポート LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024、ANR と協会から注ぐル開発銀行 de la recherche en parasitologie et médecine トロピカルとサービス deためら助成カンボジア ・ デ ・たいしかん・ ド ・ フランス アラカルト バンギ (Centrafrique)。
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
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