Rening av extracellulära innebörder, inklusive afrikanska, från blod av anjon-värmeväxlare (Diethylaminoethyl-cellulosa kolumner)
Summary
Denna metod av trypanosome separation från blod beror på deras ytladdning vara mindre negativa än blod däggdjursceller. Infekterat blod placeras och behandlas på en anjonbytaren kolumn. Metoden, den mest passande diagnostik för afrikansk trypanosomiasis, ger renad parasiter för immunologiska, biologiska, biokemiska, läkemedels- och molekylärbiologiska undersökningar.
Abstract
Denna metod kan separation av innebörder, parasiter ansvarar för djurs och människors afrikansk trypanosomiasis (HAT), från infekterat blod. Detta är den bästa metoden för diagnostik av första etappen HAT och dessutom denna parasit reningsmetod tillåter serologiska och forskning utredningar.
HATT är orsakade av tsetseflugan överförs Trypanosoma brucei gambiense och T. b. rhodesiense. Relaterade innebörder är smittämnen djur trypanosomiasis. Trypanosome identifiering är avgörande för HAT diagnos, behandling och uppföljning. Den teknik som beskrivs här är de mest känsliga parasit upptäckt teknik, anpassade till fältförhållanden för diagnos av T. b. gambiense HAT och kan slutföras inom en timme. Blod är skiktad på en anjonbytaren kolumnen (DEAE-cellulosa) tidigare justerat till pH 8 och eluering buffert tillsätts. Mycket negativt laddade blodkroppar är adsorberas på kolumnen medan de mindre negativt laddade innebörder passera. Insamlade innebörder är pelleterat genom centrifugering och observeras av mikroskopi. Parasiter är dessutom beredda utan cellulära skador samtidigt sin smittsamhet.
Renat innebörder krävs för immunologiska tester; de används i trypanolysis-analysen, guldmyntfoten i hatt serologi. Färgade parasiter utnyttjas i det kort agglutinationsprovet (CATT) för fältet serologi. Antigener från renat innebörder, såsom variant yta glykoprotein, exoantigens, används också i olika immunanalyser. Proceduren som beskrivs här är avsedd för afrikanska innebörder; kromatografi villkor måste därför anpassas till varje trypanosome stam, och mer allmänt, till blod av varje art värd däggdjur.
Dessa fascinerande patogener är enkelt renat och tillgänglig för användning i biokemiska, molekylär och cell biologi studier inklusive samtidig kultur med värdceller att undersöka värd-parasit relationer på nivån av membranreceptorer, signalering och gene uttryck; Drug test in vitro; utredning av genen borttagning, mutation eller överuttryck på metaboliska processer, cytoskeletal biogenes och parasit överlevnad.
Introduction
Metoden presenteras beskrivs här tillåter separation av innebörder, parasiter ansvarar för djurs och människors afrikansk trypanosomiasis (HAT), från blodet. Detta är den bästa metoden för diagnostik av första etappen HAT och dessutom denna parasit reningsmetod tillstånd robust serologiska och forskning undersökning.
HATT är orsakade av tsetseflugan överförs Trypanosoma brucei gambiense och T. b. rhodesiense1. Dessa protozo parasiter multiplicera extracellularly i blodet, lymfan och interstitiell vätska under det första skedet av sjukdomen (hemolymphatic skede). Den andra etappen (meningoencephalitic skede) börjar när parasiter passera blod-hjärnbarriären; neurologiska symtom, inklusive en sömnstörning, som gett sitt namn ”sömnsjuka” till denna sjukdom, är typiska för denna andra etappen2. Relaterade innebörder (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) är smittämnen djur afrikanska trypanosomosis (AAT)3.
World Health organisation (WHO) syftar till att eliminera HAT som ett folkhälsoproblem 2020 och stoppa sändningen av 20304. Den nyligen införandet snabbdiagnos tester har förbättrad serologisk diagnos1,4,5. Flera molekylära diagnostiska tester har utvecklats men deras roll i fältet diagnostik har ännu inte etablerade5. De används för att identifiera underarter av brucei gruppen och atypiska trypanosomiasis orsakas av parasiter som är ansvarig för djurens trypanosomosis6.
Påvisande av parasiten är viktigt för diagnos, behandling och uppföljning, som serologi kan ge falska positiva och tyvärr falska negativa resultat1. Mikroskopiska direkt observation av dessa hemoflagellate protister är svårt i hatt fall som orsakas av T. b. gambiense, (mer än 95% av fallen) som låg parasitemias är regeln, för hatt orsakas av T. b. rhodesiense, en stor antal parasiter är ofta närvarande i blodet. Olika koncentration tekniker har använts, såsom tjock droppe och kapillärrör centrifugering (CTC), men separation av parasiter från blodet genom en kolonn av anjonbytaren (DEAE-cellulosa) följt av centrifugering och mikroskopisk observation av den pellets, är den känsligaste metoden (cirka 50 parasiter/mL blod kan upptäckas)1,7. Följaktligen, rening av innebörder av anjon-värmeväxlare (DEAE-cellulosa) metoden är bäst och hittills, referensmetod för visualisering och isolera parasiter från blod för HAT diagnos. I fältet villkor, en mini kolumn av DEAE-cellulosa har använts framgångsrikt och flera förbättringar har underlättat mikroskopiska observation7,8.
Metoden av trypanosome separation från blod, beskrivs nedan, är beroende av parasiten ytladdning, vilket är mindre negativa än blod däggdjursceller9. Intressant, denna metod utvecklades för 50 år sedan 1968 av Dr Sheila Lanham, och är fortfarande den gyllene standarden för upptäckt och beredning av blodomloppet innebörder. Det är snabbt och reproducerbara för salivarian innebörder från ett brett utbud av däggdjur, tillåter diagnos av både djur och människor trypanosomiasis10.
För att få levande, renat parasiter, läggs infekterat blod på en anjonbytaren kolumnen. Kromatografi förhållanden (främst pH, jonstyrka av buffertar/media) måste anpassas till varje trypanosome art och, mer allmänt, till varje blandning av blod däggdjursceller och innebörder10. Eluering buffert är exakt justerad till pH 8 för de flesta afrikanska innebörder10. Denna metod gynnar koncentrationen av parasiter i blodet hos patienter, eftersom parasitemias kan vara för låga för att upptäckas av mikroskopisk observation ensam, och det gör också laboratorieundersökningar. Arbeta med nymalen isolerade innebörder och på blod från infekterade djur, använder denna teknik, är mer relevant för olika utredningar än studier med parasiter som har varit odlade i axenic förhållanden i laboratoriet på obestämd tid.
Värd-parasit relationer studeras bäst med en parasiten infekterar sin naturliga värd, därför T. musculi, en naturlig murina parasit, som är representativt av extracellulära innebörder, har många fördelar som murina infektion innebär i en litet laboratorium djur och kräver inte biohazard säkerhet nivå (BSL) villkor. T. musculi dödar inte immunkompetenta möss, till skillnad från många andra arter, Trypanosoma , inklusive mänskliga patogener. T. musculi elimineras inte i T-cell-berövade möss och parasitemias kan ökas i infekterade möss genom att ändra mat och näring intag11. Denna parasit modulerar immunsvaret i samtidiga infektioner med andra patogener12. T. musculi från infekterade möss uppvisar skillnader från odlade T. musculi, till exempel uttrycket av membran Fc receptorer är förlorat i T. musculi axenic kulturer, jämfört med parasiter som renats från infekterade möss13 , 14. Excreted-utsöndras faktorer (ESF) är också kvalitativt och kvantitativt mindre uttryckt i axenic trypanosome kulturer och skiljer sig mellan stammar isolerade i endemiska områden15. ESF är de första antigenerna ska visas på värd immunsystemet och så spelar en viktig roll i den första värddatorn immunsvar16.
I experimentellt infekterade djur för laboratorieundersökningar underlättar detta protokoll experimenterande på ett större antal parasiter, minimering av antalet möss krävs särskilt när du använder immunsupprimerade djur. De variant yta glykoproteiner (VSGs) som används i det kortet agglutinationsprovet för Trypanosomiasis (CATT) massa screening fortfarande renas från innebörder som sprids i råttor. De två snabba diagnostiska tester (individuellt förpackade kassetter) som nu finns tillgängliga för användning i fältet fortfarande använder en infektiös modell källa av infödda VSGs och inte i vitro odlade innebörder1,4, 5. befordran i studien av trypanosome immunologi och biologi har underlättats eftersom parasiterna DEAE-cellulosa renat lätt kan erhållas i stora mängder från naturligt eller experimentellt infekterade värdar, och i synnerhet gnagare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Renat innebörder representerar ett kraftfullt medel för att studera immunologi, biokemi, cell- och molekylärbiologi. Stora vidder av data och resultat har erhållits från innebörder, som har sedan hjälpt till att få information från andra eukaryota celler30. Innebörder är också viktig och intressant forskning, eftersom de har utarbetat ett flertal mekanismer som tillåter dem att överleva och växa i två mycket olika miljöer: tsetseflugan vektorn och däggdjur värd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla medlemmar i UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Denna forskning stöddes av intern finansiering från universitetet i Bordeaux och stöd från ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, och föreningen pour le développement de la recherche sv Parasitologien et médecine tropicale och den Service de coopération et d’action culturelle de l’Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?. Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host’s parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
