Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)
Summary
Questo metodo di separazione Tripanosoma dal sangue dipende dalla loro carica superficiale essendo meno negativo rispetto a cellule del sangue dei mammiferi. Sangue infetto è collocato e trattati su una colonna di scambiatore di anioni. Questo metodo, più il montaggio diagnostico per la tripanosomiasi africana, fornisce parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologia molecolare.
Abstract
Questo metodo consente la separazione dei tripanosomi, parassiti responsabili di tripanosomiasi africana umana e animale (HAT), da sangue infetto. Questo è il metodo migliore per la diagnosi della prima fase cappello e inoltre questo metodo di purificazione del parassita permessi sierologico e le indagini di ricerca.
CAPPELLO è causato da Mosca Tse-Tse trasmessi Trypanosoma brucei gambiense e rhodesiense del t.b.. Trypanosomes correlate sono gli agenti causali di tripanosomiasi animale. Rilevamento di Tripanosoma è essenziale per la diagnosi, trattamento e follow-up di cappello. La tecnica qui descritta è la tecnica più sensibile di rilevazione parassita, adattata alle condizioni del campo per la diagnosi del gambiense del t.b. cappello e può essere completata entro un’ora. Sangue è a strati su una colonna di scambiatore di anioni (DEAE cellulosa) precedentemente regolata a pH 8 e tampone di eluizione viene aggiunto. Caricate altamente negativa globuli sono adsorbiti sulla colonna mentre il meno negativamente trypanosomes passano attraverso. Trypanosomes raccolti sono pellettati mediante centrifugazione e osservata da microscopia. Inoltre, i parassiti sono preparati senza danno cellulare, pur mantenendo la loro infettività.
Purificata trypanosomes sono necessari per i test immunologici; sono utilizzati nell’analisi della trypanolysis, il gold standard nella sierologia di cappello. Macchiato parassiti sono utilizzati nel test di agglutinazione di carta (CATT) per sierologia di campo. Gli antigeni da trypanosomes purificata, come variante della glicoproteina di superficie, esoantigeni, sono utilizzati anche in vari test immunologici. La procedura qui descritta è progettata per tripanosomi africani; di conseguenza, devono essere adattati per ogni ceppo di Tripanosoma e più in generale, per il sangue di ogni specie di mammifero ospite cromatografia condizioni.
Queste affascinanti gli agenti patogeni sono facilmente purificato e disponibile per l’uso biochimici, molecolari e cellulari tra cui co-coltura con cellule dell’ospite per indagare le relazioni ospite-parassita a livello dei recettori di membrana, segnalazione e gene di studi di biologia espressione; droga test in vitro; indagine di omissione del gene, mutazione o sovraespressione sui processi metabolici, biogenesi del citoscheletro e sopravvivenza del parassita.
Introduction
Il metodo presentato descritto qui consente la separazione dei tripanosomi, parassiti responsabili di tripanosomiasi africana umana e animale (HAT), dal sangue. Questo è il metodo migliore per la diagnosi della prima fase cappello e inoltre questo metodo di purificazione del parassita permessi robusto indagine sierologica e di ricerca.
CAPPELLO è causato da Mosca Tse-Tse trasmessi Trypanosoma brucei gambiense e rhodesiense del t.b.1. Questi protozoi parassiti si moltiplicano extracellularly nella circolazione sanguigna, linfatica e fluidi interstiziali durante la prima fase della malattia (stadio emolinfatico). La seconda fase (fase meningoencephalitic) inizia quando i parassiti attraversano la barriera ematoencefalica; segni neurologici, tra cui un disturbo del sonno, che ha dato il suo nome “malattia del sonno” per questa malattia, sono tipici di questa seconda fase2. Trypanosomes correlate (T. evansi, T. congolense, vivax T. brucei b. T.) sono gli agenti causali di animale africano Tripanosoma (AAT)3.
L’organizzazione mondiale della sanità (OMS) mira all’eliminazione cappello come un problema di salute pubblica entro il 2020 e di fermare la trasmissione di 20304. La recente introduzione di test di diagnosi rapida ha una migliore diagnosi sierologica1,4,5. Diversi test diagnostici molecolari sono stati sviluppati ma il loro ruolo nella diagnostica sul campo non è stato ancora stabilito5. Essi vengono utilizzati per identificare la sub-specie del gruppo brucei e tripanosomiasi atipica causata da parassiti responsabili di animale Tripanosoma6.
La rilevazione del parassita è essenziale per la diagnosi, trattamento e follow-up, come la sierologia può dare risultati falsi positivi e purtroppo falsi negativi1. L’osservazione microscopica diretta di questi protisti emoflagellato è difficile nei casi di cappello che sono causati da gambiense del t.b., (più di 95% dei casi) come bassi parassitemie sono la regola, mentre per il cappello causato da rhodesiense del t.b., un grande numero di parassiti sono spesso presente nel sangue. Sono state utilizzate varie tecniche di concentrazione, come goccia spessa e centrifugazione tubo capillare (CTC), ma la separazione dei parassiti dal sangue di una colonna di scambiatore di anioni (DEAE cellulosa) seguita da centrifugazione e osservazione al microscopio della a pellet, è il metodo più sensibile (può essere rilevato circa 50 parassiti/mL di sangue)1,7. Di conseguenza, la purificazione di trypanosomes da questo metodo di anione-scambiatori (DEAE cellulosa) è il migliore e, ad oggi, il metodo di riferimento per la visualizzazione e isolare i parassiti dal sangue per la diagnosi di cappello. In condizioni di campo, una mini-colonna di DEAE cellulosa è stata utilizzata con successo e diversi miglioramenti hanno facilitato l’osservazione microscopica7,8.
Il metodo di separazione Tripanosoma dal sangue, descritto di seguito, dipende dalla carica superficiale del parassita, che è meno negativo di cellule del sangue dei mammiferi9. Interessante, questo metodo è stato sviluppato 50 anni fa, nel 1968 da Dr. Sheila Lanham e rimane il gold standard per il rilevamento e la preparazione dei tripanosomi flusso sanguigno. È veloce e riproducibile per salivarian trypanosomes da una vasta gamma di mammiferi, permettendo la diagnosi di entrambi di tripanosomiasi animale e umano10.
Per ottenere parassiti living, purificati, sangue infetto è aggiunto su una colonna di scambiatore di anioni. Condizioni di cromatografia (principalmente pH, forza ionica del buffer e media) devono essere adattati ad ogni specie di Tripanosoma e più in generale, ad ogni mix di cellule del sangue dei mammiferi e trypanosomes10. Tampone di eluizione è regolato precisamente a pH 8 per l’africano trypanosomes10. Questo metodo favorisce la concentrazione di parassiti trovati nel sangue dei pazienti, perché parassitemie può essere troppo bassa per essere rilevata da osservazione microscopica da solo, e permette anche le indagini del laboratorio. Lavorare con trypanosomes appena isolate e il sangue di animali infetti, utilizzando questa tecnica, è più pertinente per varie indagini rispetto agli studi con i parassiti che sono stati coltivati in condizioni axeniche in laboratorio per un periodo indefinito.
Rapporti ospite-parassita sono meglio studiati con un parassita che infetta il sua ospite naturale, pertanto, musculi T., un parassita murino naturale, che è rappresentante di trypanosomes extracellulare, ha molti vantaggi come infezione murina coinvolge un piccolo laboratorio animale e non necessita di condizioni di livello (BSL) di sicurezza biohazard. T. musculi non uccidere i topi immunocompetenti, a differenza di molte altre specie di Trypanosoma , tra cui agenti patogeni umani. T. musculi non vengono eliminate in topi privati del T cell e parassitemie può essere aumentato in topi infettati modificando l’assunzione degli elementi nutritivi e cibo11. Questo parassita modula la risposta immunitaria in co-infezioni con altri agenti patogeni12. T. musculi da topi infetti esibire differenze da coltivate musculi T., ad esempio, l’espressione di recettori di membrana Fc viene perso in T. musculi colture axeniche, rispetto ai parassiti purificati da topi infetti13 , 14. fattori secreti Excreted (FSE) sono anche qualitativamente e quantitativamente meno espressa nelle colture axeniche Tripanosoma e differiscono tra i ceppi isolati in zone endemiche15. FSE sono gli antigeni primi da visualizzare per il sistema immunitario dell’ospite e quindi giocare un ruolo importante nell’host iniziale risposta immunitaria16.
Negli animali infettati sperimentalmente per le indagini del laboratorio, questo protocollo facilita la sperimentazione su un maggior numero di parassiti, riducendo al minimo il numero di topi necessaria soprattutto quando si utilizzano animali immunodepressi. Le glicoproteine di superficie variante (generatori di segnale vettoriale) che vengono utilizzate nel Test di agglutinazione di carta per tripanosomiasi (CATT) in screening di massa sono ancora purificate da trypanosomes che vengono propagati in ratti. I due test diagnostici rapidi (confezionati singolarmente cassette) che sono ora disponibili per l’uso in campo, ancora utilizza un’origine infettiva modello nativo generatori di segnale vettoriale e non in vitro coltivate trypanosomes1,4, 5. l’avanzamento nello studio del Tripanosoma immunologia e biologia è stata facilitata dal momento che questi parassiti DEAE cellulosa purificata possono essere facilmente ottenuti in grandi quantità dai padroni di casa naturalmente o sperimentalmente infetti e in particolare, roditori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Purificata trypanosomes rappresentano un potente mezzo per studiare immunologia, biochimica, biologia molecolare e cellulare. Grandi distese di dati e risultati sono state ottenute da trypanosomes, che ha poi contribuito a ottenere informazioni dalle altre cellule eucariotiche30. Trypanosomes sono anche oggetto di ricerca importante e interessante, perché essi hanno messo a punto numerosi meccanismi che consentono loro di sopravvivere e crescere in due ambienti molto diversi: il vettore di Mosca …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i membri di UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti interni da Università di Bordeaux e supporto dall’ANR, LABEX ANR ParaFrap-11-LABX-0024 e dall’associazione pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale e il de servizio Coopération et d’Action culturelle de l’Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
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