Positron-emissie tomografie (PET) imaging sites die bij meerdere vroege proeven van het klinisch onderzoek betrokken zijn moet robuust en veelzijdig radiotracer productie mogelijkheden. Met behulp van de radiotracer [18F] Clofarabine als voorbeeld illustreren we hoe te automatiseren de synthese van een radiotracer met behulp van een flexibele, cassette gebaseerde radiosynthesizer en valideren van de synthese voor klinisch gebruik.
De ontwikkeling van nieuwe positron-emissie tomografie (PET) traceurs is het inschakelen van onderzoekers en clinici om het imago van een steeds breder scala aan biologische doelstellingen en processen. Echter, het toenemende aantal verschillende traceurs maakt uitdagingen voor hun productie op radiopharmacies. Terwijl historisch al het praktische te wijden een radiosynthesizer maat geconfigureerd en hete cel voor de herhaalde productie van elke individuele tracer, is het steeds noodzakelijk deze werkstroom wijzigen. Recente commerciële radiosynthesizers op basis van wegwerp cassettes/kits voor elke tracer vereenvoudigen de productie van meerdere traceurs met één set van apparatuur door eliminerend de behoefte aan aangepaste tracer-specifieke wijzigingen. Bovendien kunnen sommige van deze radiosynthesizers de exploitant te ontwikkelen en optimaliseren van hun eigen protocollen van de synthese naast de aankoop van commercieel beschikbare kits. In dit protocol, wij beschrijven de algemene procedure voor hoe de handmatige synthese van een nieuwe PET-tracer op één van deze radiosynthesizers kan worden geautomatiseerd en gevalideerd voor de productie van klinische-grade verklikstoffen. Als voorbeeld, gebruiken we de ELIXYS radiosynthesizer, een flexibele cassette gebaseerde radiochemie tool die ondersteunen kan zowel PET tracer ontwikkelingsinspanningen, evenals de productie van routinematige klinische sonde op hetzelfde systeem, om te produceren [18F] Clofarabine ([ 18 F] CFA), een huisdier tracer te meten in vivo deoxycytidine kinase (dCK) enzymactiviteit. Vertalen van een handmatige synthese gaat afbreken van het synthetische protocol in fundamentele radiochemie processen die worden vervolgens vertaald in intuïtieve chemie “bewerkingen” ondersteund door de software synthesizer. Deze operaties kunnen vervolgens snel worden omgezet in een geautomatiseerde synthese-programma door het assembleren met de drag-and-drop interface. Na het testen van de basis, de synthese en zuivering procedure kan het nodig van optimalisatie te bereiken van de gewenste opbrengst en zuiverheid. Zodra de gewenste prestaties is bereikt, wordt een validatie van de synthese uitgevoerd om te bepalen van de geschiktheid ervan voor de productie van de radiotracer voor klinisch gebruik.
Een toenemende matrix van biologische doelstellingen dynamisch kan worden gevisualiseerd in levende onderwerpen via de moleculaire beeldvorming modaliteit PET. PET biedt in vivo tests van specifieke biologische, biochemische en farmacologische processen met behulp van specifieke radiotracers (moleculen aangeduid met radionucliden positron-emitting) die worden ingespoten in het onderwerp voorafgaand aan1imaging. Het toegenomen gebruik van huisdier te bestuderen van een breed scala aan deze processen in basiswetenschap en klinisch onderzoek2,3,4, en in de ontdekking, ontwikkeling en klinische gebruik van drugs in patiëntenzorg5, 6, leidt tot een groeiende vraag naar gevarieerde radiotracers7,8. Om te voorkomen dat blootstelling van de radiochemicus en ervoor te zorgen een reproduceerbare productie van deze kortstondige verklikstoffen, worden ze meestal geproduceerd met behulp van een geautomatiseerde radiosynthesizer die in een “hete cel”. Recente radiosynthesizers gebruiken een wegwerp-cassette/kit architectuur ter vereenvoudiging van de taak van het voldoen aan klinisch-grade productie waarbij ook de flexibiliteit om te bereiden meerdere soorten radiotracers door simpelweg omwisselen van cassettes9 . In de vroege stadia van de klinische zijn er echter meestal geen verkrijgbare cassettes/kits voor het uitvoeren van de geautomatiseerde radiosynthesis; Bijgevolg, worstelen PET drug productiefaciliteiten voor het aanpassen van de systemen voor de uitvoering van cGMP-grade tracer productiecapaciteiten binnen een passende termijn en tegen een redelijke prijs. Dus hebben radiosynthesizers ontwikkeld dat de cassette/kit architectuur met functies combineren voor het vergemakkelijken van de ontwikkeling en de optimalisatie van de verklikstoffen.
De ELIXYS FLEX/CHEM (ELIXYS) is een voorbeeld van een flexibele cassette gebaseerde radiosynthesizer met een brede reagens, oplosmiddel en reactie temperatuur compatibiliteit10. Het heeft drie schepen van de reactie en gebruikt een robotachtige mechanisme dynamisch configureren van de vloeistof weg als vereist door een bepaalde synthese protocol11. De synthesizer software voorziet in de oprichting van synthese programma’s (reeksen) verschillende traceurs door slepen en neerzetten, Bewerkingen zoals Trap isotoop Elueer isotoop, Toevoegen reagens, reageren, en verdampen12. Elke eenheid bewerking heeft een scala aan programmeerbare parameters beschikbaar aan de exploitant, zoals duur, temperatuur, of onder inert gas rijden druk (Druk). Door het begrijpen van de aard van elke actie van de eenheid, een handmatige synthese kan gemakkelijk worden omgezet in een reeks van bewerkingen en vervolgens tijdens de optimalisatie van het protocol13worden gewijzigd. In combinatie met de ELIXYS PURE/FORM module, kan het geïntegreerde systeem een geautomatiseerde zuivering en de formulering van de PET-tracer ook uitvoeren. Met behulp van deze radiosynthesizer, hebben we eerder gemeld de geautomatiseerde synthese van 24 verschillende 18F-geëtiketteerden verklikstoffen en prosthetic groepen11,14,15,16, als evenals de geautomatiseerde enzymatische radiofluorination van biomoleculen17, door simpelweg het veranderen van reagentia en niet de configuratie van het systeem. Anderen hebben aangetoond dat de geautomatiseerde synthese van [18F] RO6958948 voor de beeldvorming van tau neurofibrillary klitten18, de geautomatiseerde synthese van de prosthetic groep [18F] F-Py-TFP met een latere labeling van peptiden19 , en de geautomatiseerde synthese van [18F] AM580 voor de beeldvorming van fosfodiësterase 10a (PDE10A)20. Bovendien verschillende groepen hebben aangetoond de productie van verklikstoffen geschikt voor klinisch gebruik, met inbegrip van 4-[18F] Fluorobenzyl-bijvoorbeeld ([18F] FBnTP) voor de beeldvorming van de mitochondriale membraan potentiële21, [ 18 F] DCFPyL voor de beeldvorming van de membraan van de prostaat specifiek antigeen (PSMA)22, en [18F] THK-5351 voor de beeldvorming van tau23.
In deze paper, we gebruiken onze ervaring met [18F] CFA om te illustreren hoe een handmatige radiosynthetic-procedure kan worden eenvoudig en snel vertaald in een geautomatiseerde synthese geschikt voor routinematige productie cGMP-richtlijnen. De tracer [18F] CFA is ontworpen voor de beeldvorming van dCK activiteit. De handmatige radiosynthesis [18F] CFA werd oorspronkelijk beschreven door Shu et al. 24 als een procedure met behulp van twee schepen van de reactie, tussenliggende silica cartridge zuivering en een definitieve HPLC zuivering stap (Zie Aanvullend materiaal, deel 1 voor details). Recent in vitro en preklinische studies hebben aangetoond de uitzonderlijke specificiteit van deze tracer te dCK, en eerste-in-menselijke studies hebben aangetoond gunstige ook25. Er is een onmiddellijke belangstelling voor bredere schaal klinische studies om de gevoeligheid van [18F] te bevestigen CFA-huisdier variaties in dCK activiteit en een op langere termijn belang hebben bij de mogelijke klinische toepassingen van deze tracer26. Het kan een nuttige biomarker voor therapieën die leiden tot T-cel activatie, DNA-schade veroorzaken of dCK-afhankelijke nucleoside analoge prodrugs afhankelijk zijn. In het bijzonder [18F] CFA kunnen de gelaagdheid van patiënten voor een eventuele reactie op behandeling met Clofarabine. [18F] CFA kan ook vergemakkelijken de studie en de ontwikkeling van dCK remmers die naar klinische proeven rukken. Aangezien deze tracer heeft traditioneel handmatig is gesynthetiseerd, bevorderen van al deze studies vereist een betrouwbare, geautomatiseerde synthese van [18F] CFA geschikt voor klinisch gebruik.
Hoewel we eerder gemeld een geautomatiseerde synthese van [18F] CFA voor preklinische studies16, dit protocol bouwt verder op deze inspanningen en een beschrijving van de aanvullende wijzigingen die nodig zijn voor de klinische productie van deze tracer, met inbegrip van de integratie van de volautomatische reiniging en formulering, protocol validatie en kwaliteitscontrole tests. De algemene procedures die hier worden beschreven zijn niet beperkt tot de ontwikkeling van een geautomatiseerd en klinisch-geschikt synthese van [18F] CFA maar kan worden gegeneraliseerd op een eenvoudige manier om geautomatiseerde syntheses geschikt voor klinisch gebruik van andere radiotracers gemarkeerd met fluor-18.
Dit protocol bepaalt welke basisstappen bij het automatiseren van een handmatige synthese-protocol moeten worden gehouden om de productie van klinische rang tracer formulering. De hele ontwikkelingscyclus, inclusiefontwikkeling van de kwaliteitscontrole, wordt geïllustreerd door de radiotracer [18F] CFA (voor de beeldvorming van dCK activiteit). Bijzondere aandacht ging naar de geautomatiseerde synthese wijzigen om ervoor te zorgen de tracer de geschiktheid voor klinisch gebruik. De synthese met zich meebrengt fundamentele processen zoals de activering van [18F] fluoride, radiofluorination van de voorloper molecuul, tussentijdse cartridge zuivering, bescherming-groep verwijdering, en semi-preparatieve HPLC zuivering en formulering voor injectie. Deze basisprocessen bestaan uit een standaard repertoire dat voldoende is voor de synthese van de overgrote meerderheid van 18F-geëtiketteerden PET verklikstoffen.
Terwijl het ontwerpen van de synthese, is de keuze van reagentia en hun kwaliteitsborging van bijzonder belang voor klinisch gebruik. Zorgen voor de juiste programmering en goede verbindingen door het uitvoeren van een mock synthese (alleen oplosmiddelen) is noodzakelijk om te elimineren onverwachte fouten wanneer de synthese is uitgevoerd met radioactiviteit. De daaropvolgende synthese optimalisaties (oplosmiddelen, volumes, hoeveelheden, temperaturen, reactietijden en zuivering voorwaarden) is afhankelijk van de specifieke PET tracer in ontwikkeling. Tijdens deze experimenten, moet bijzondere aandacht worden scheen op de chemische en radiochemische zuiverheid van het eindproduct die kan worden bereikt, zoals deze moeten voldoen aan strenge eisen voor klinisch gebruik. Een synthese die betrouwbaar een puur product lager maar voldoende activiteit rendementen produceert is meestal voorkeur over een hoog-opbrengt proces dat een risico is te mislukken sporadisch. Zodra de synthese adequaat is geoptimaliseerd, moet het laatste proces ondergaan validatietests uit (een reglementair vereiste) om klinische geschiktheid. De gevalideerde synthese-methode kan vervolgens worden gebruikt voor de productie van de PET-tracer voor klinisch gebruik. Wanneer een huisdier tracer volgens een gevalideerde methode synthese, moet de standaardwerkvoorschriften grondig worden gevolgd. Om ervoor te zorgen dat, is de software geprogrammeerd om de operator bevestigen de voltooiing van belangrijke stappen via een vooraf uitvoeren controlelijst na het klikken op uitvoeren om te beginnen de synthese. Terwijl het systeem de synthese op een geautomatiseerde wijze uit te voeren zal, vereist de zuivering stap manuele interventie. De exploitant moet daarom nauw observeren de chromatografische scherm tijdens de HPLC-zuivering en handmatig invoeren in real-time wanneer naar start en stop het verzamelen van de Fractie van het product.
Binnen onze automatisering en optimalisatie inspanningen voor de synthese van de CFA-[18F], hebben we gestroomlijnd de semi-preparatieve zuivering HPLC-methode van het mengsel van het product met behulp van een injecteerbare oplosmiddel systeem bestaande uit ammonium acetaat oplossing en EtOH ; onze vorige methode vereist een extra stap te wisselen van het oplosmiddel na zuivering16. De volgende formulering proces, dus moet alleen verminderen de EtOH inhoud van de verzamelde Fractie om toleranties, en om haar isotonicity, die beide kunnen worden bereikt door verdunning. De formulering stap werd uitgevoerd met behulp van een tweede programma dat bestaat uit een enkele formulering eenheid bewerking toe variabele volume toevoegingen van NaCl-oplossingen aan het gezuiverde product fractie via de module van de formulering ter verantwoording voor de variabele het volume wordt verkregen na zuivering van HPLC. Als het volume van de breuk verzamelde product is ingesteld op constante in plaats daarvan, kan de werking van de eenheid formulering worden opgenomen in het programma van de belangrijkste synthese, het vermijden van de behoefte aan een onafhankelijk programma. Een alternatieve benadering om te voorkomen dat handmatige interventie zou moeten gebruiken van de volledige functionaliteit van de formulering module (bijvoorbeeldde gezuiverde tracer met water verdund, val op een C18 solid-phase extraction cartridge, wassen, het Elueer met een vaste hoeveelheid EtOH en ten slotte, Verdun het met een vaste hoeveelheid zoutoplossing).
De techniek die hier gepresenteerd voor automatiseren en valideren van een synthese protocol voor klinische gebruik beoogt te zijn vrij algemeen. Door de keuze van radiosynthesizer (ELIXYS), kan een breed scala van syntheses worden geautomatiseerd en gevalideerd. Dit omvat complexe 3-pot syntheses, of waarbij hoge temperaturen van vluchtige oplosmiddelen syntheses. Optimaliseren van een synthese kan worden bereikt door het veranderen van de parameters van het softwareprogramma. De synthesizer heeft functies voor het controleren van de impact van veranderingen, zoals plaatsbepaling van de vaartuigen van de reactie voor de verwijdering van monsters voor radio-TLC of radio-HPLC analyse. Echter zonder wijzigingen van het systeem, het systeem momenteel niet mogelijk is om de behandeling van zeer lage reagens volumes (~ 5-20 µL), tussenproduct distillatie, of de behandeling van [18F] AlF, 68Ga, of andere radiometals. Als de handmatige synthese worden geautomatiseerd bevat dergelijke stappen, maar ze kunnen niet worden omzeild, automatisering en validatie met een ander radiosynthesizer platform kunnen worden gehouden.
Hoewel dit werk heeft gericht op de ontwikkeling van een protocol voor de geautomatiseerde productie van [18F] CFA voor klinisch gebruik, de synthese van vele andere PET traceurs kan worden geautomatiseerd op een manier die geschikt is voor de productie van de klinische, volgt dezelfde logica en methoden. Naar aanleiding van de methode die hier gepresenteerd, hebben we ook de geautomatiseerde synthese van 9 – aangepast (4-[18F] fluoro – 3-[hydroxymethyl] butyl) guanine ([18F] FHBG) en het gevalideerd voor klinisch gebruik. Gebruiker in de Gemeenschap gevestigde protocollen kunnen worden geüpload naar en van het SOFIE Probe netwerk, een webportal voor het delen van synthese programma’s gedownload en bijbehorende documentatie onder verschillende Radiofarmacie sites27. Dit kan voorkomen dat een verdubbeling van de inspanningen in de Gemeenschap en multi centrum klinische studies met betrekking tot huisdier imaging vergemakkelijken.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Cancer Institute (R44 CA216539) en de Stichting van de UCLA uit een donatie gemaakt door Ralph en Marjorie Crump voor de UCLA Crump Instituut voor Molecular Imaging.
ELIXYS FLEX/CHEM | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1010001 | Radiosynthesizer |
Radiosynthesizer cassette | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1861030400 | Cassette for ELIXYS FLEX/CHEM |
ELIXYS PURE/FORM | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1510001 | Radiosynthesizer purification module |
[O-18]H2O | IBA RadioPharma Solutions (Reston, VA, USA) | IBA.SP.065 | >90% isotopic purity |
[F-18]fluoride in [O-18]H2O | UCLA | N/A | Produced in a cyclotron (RDS-112; Siemens; Knoxville, TN, USA) by the (p,n) reaction of [O-18]H2O. Bombardment at 11 MeV using a 1 mL tantalum target with havar foil. |
Deionized water | UCLA | N/A | Purified to 18 MΩ and passed through 0.1 µm filter |
Acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 271004 | Anhydrous, 99.8% |
Ethanol (EtOH) | Decon Laboratories, Inc. (King of Prussia, PA, USA) | 2701 | Anhydrous, 200 proof |
Sodium hydroxide (NaOH) solution | Merck (Burlington, MA, USA) | 1.09137.1000 | 1M solution |
Hydrochloric acid (HCl) solution | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | SA48-500 | 1M solution |
Ethyl acetate (EtAc) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | E195SK-4 | HPLC grade |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | S-640-500 | USP grade |
Ammonium acetate | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | A639-500 | HPLC grade |
Potassium carbonate (K2CO3) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | P-208-500 | Certified ACS |
CFA precursor | CalChem Synthesis (San Diego, CA, USA) | N/A | Custom synthesis |
Cryptand 222 (K222; Kryptofix 2.2.2) | ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg, Germany) | 800.1000 | >99% |
Sodium chloride (NaCl) solution (saline) | Hospira (Lake Forest, IL, USA) | 0409-4888-02 | 0.9%, for injection, USP grade |
Silica cartridge | Waters (Milford, MA, USA) | WAT051900 | Sep-pak Classic |
Quaternary methylammonium (QMA) cartridge | Waters (Milford, MA, USA) | WAT023525 | Sep-pak Light Plus |
Sterile syringe filter (0.22 µm) | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | SLGSV255F | Millex-GV |
Glass V-vial (5 mL) | Wheaton (Millville, NJ) | W986259NG | Used for reaction vessels |
Septa | Wheaton (Millville, NJ) | 224100-072 | Used for reagent vials |
Crimp cap | Wheaton (Millville, NJ) | 224177-01 | Used for reagent vials |
Amber serum vial (2 mL) | Voigt (Lawrence, KS, USA) | 62413P-2 | Used for reagent vials |
Magnetic stir bar | Fisher Scientific (Hampton, NH, USA) | 14-513-65 | Used for reaction vessels |