Summary

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Abstract

Sezernierten Faktoren, Membran-angebunden-Rezeptoren und ihren Interaktionspartnern sind wichtigsten Regulatoren des Mobilfunkes und Einleitung der Signalisierung Kaskaden während der Homöostase und Krankheit, und als solche therapeutischen Ziele dar. Trotz ihrer Relevanz bleiben diese Interaktion Netze deutlich unterrepräsentiert in aktuellen Datenbanken; Daher müssen die extrazellulären Proteine keine dokumentierten Bindungspartner. Diese Diskrepanz ist vor allem auf die Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Studium der extrazellulären Proteine, einschließlich Ausdruck Funktionsproteine und der schwachen, niedrige Affinität, Protein-Interaktionen, die oft zwischen Zellrezeptoren Oberfläche hergestellt. Diese Methode dient zum Drucken einer Bibliothek von extrazellulären Proteinen in einem Microarray-Format für das Screening von Protein-Protein-Wechselwirkungen beschreiben. Zur Erkennung der schwachen Wechselwirkungen zu ermöglichen, wird eine Methode basiert auf Multimerization des Proteins Abfrage unter Studie beschrieben. Dabei Microbead-basierte Multimerization für erhöhte Multivalenz gekoppelt, ermöglicht die Protein-Microarray robuste Erkennung von transienten Protein-Protein-Interaktionen in hohem Durchsatz. Diese Methode bietet einen schnellen und niedrigen Probe verbraucht-Ansatz zur Identifizierung von jedem extrazelluläre Protein für neue Interaktionen. Protein-Microarray-Druck und screening-Protokoll werden beschrieben. Diese Technologie wird für die Ermittler suchen eine robuste Methode zur Entdeckung von Protein-Interaktionen in den Extrazellulärraum nützlich sein.

Introduction

Die Methode überprüft hier beschreibt das Drucken aus einer Sammlung von extrazellulären Proteine in einem Microarray-Format, gefolgt von einer Methode für das Screening eines Ziels des Interesses gegen diese Bibliothek. Wir haben als ein entscheidender Schritt für die Erkennung von Interaktionen gekennzeichnet durch niedrige verbindliche Affinitäten Protein Multimerization identifiziert. Zur Erkennung dieser Interaktionen zu verbessern, beschreiben wir ein Protokoll basiert auf Multimerization der Abfrage-Proteins des Interesses mit Microbeads.

Sezerniert und Oberfläche ausgedrückt Zellproteinen (kollektiv extrazellulären Proteine genannt) zusammen mit ihren Interaktionspartnern sind wichtige Regulatoren des Mobilfunkes, Signalisierung und Interaktion mit der Mikroumgebung. Sie sind daher unerlässlich bei der Regulierung der vielen physiologischer und pathologischer Prozessen. Etwa ein Viertel des menschlichen Genoms (≈5, 000 Proteine) für extrazelluläre Proteine kodiert, die aufgrund ihrer Bedeutung und Zugänglichkeit systematisch gelieferten Medikamente, wesentliche Ziele für Droge-Entwicklung-1vertreten. Folglich stellen extrazellulären Proteine mehr als 70 % der Protein-Targets mit bekannten pharmakologischen Wirkung für zugelassene Medikamente auf dem Markt, bekannt als das “druggable Proteom”. Trotz ihrer Bedeutung und Fülle bleiben die extrazelluläre Protein-Protein Interaktion (ePPI) Netze auffallend unterrepräsentiert in den verfügbaren Datenbanken. Dies ist grundsätzlich aufgrund der komplexen biochemischen Natur der extrazellulären Proteine, die deren Charakterisierung mit den meisten verfügbaren Technologien2ausschließt. Erstens sind Membranproteine schwer zu lösen, einen Prozess, der oft harten waschen Bedingungen und Reinigungsmittel beinhaltet; Zweitens fehlt extrazellulären Proteine häufig relevanten post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung, die fehlen, wenn diese Proteine in allgemein ausgedrückt werden heterologe Systemen verwendet. Schließlich, Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren, wie Co-Rezeptoren auf Immunzellen, ausgedrückt sind oft vorübergehend und zeichnet sich durch sehr niedrige Affinitäten (K-D in ~ 1 μM bis > 100 μM-Bereich). Insgesamt verwendet die Natur dieser Proteine und deren Bindung, die am weitesten verbreitete Partner erbringen Technologien wie Affinität Reinigung/Massenspektrometrie (AP/MS) oder Hefe-zwei-Hybrid, ungeeignet für die Erkennung von Interaktionen in den Extrazellulärraum 2 , 3.

In dem Bemühen, diese technische Herausforderungen zu meistern und beschleunigen die Entdeckung neuartiger Interaktionen für extrazelluläre Proteine entwickelten wir eine hohe Abdeckung extrazelluläre Protein Microarray4,5. Microarrays bieten den Vorteil hoher Dichte Oberflächen mit kleinen Probenmengen zu erzeugen und sind in der Regel für Hochdurchsatz Studien zugänglich. Protein Microarray-basierte Studien haben bereits relevante Einblicke in Protein-Interaktionen für mehrere Modellorganismen vorgesehen, allerdings mit Schwerpunkt vor allem auf cytosolischen Interaktionen oder spezifisches Protein Familien6,7, 8. Im Gegensatz dazu hat begrenzte gearbeitet um extrazelluläre Protein-Interaktionen mit dieser Technologie zu untersuchen. Haben wir eine Protein Microarray Methode zum Studium der ePPIs ermöglichen durch den Aufbau einer umfassenden und vielseitigen Bibliothek der gereinigten sekretierten Proteine und einzelne transmembrane (STM) Rezeptoren ausgedrückt als rekombinante extrazelluläre Domänen (ECD) verschmolzen häufige Tags für Affinität Reinigung4. Der Erfolg der Protein-Microarray-Bildschirme stützt sich auf die Schaffung einer qualitativ hochwertigen Protein-Bibliothek. Für den Ausdruck von der Bibliothek und die Abfrage Protein wurden Säugerzellen oder Insektenzellen bevorzugt als heterologe Expressionssysteme gewählt um richtige Zugabe von post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung oder umgeformt Anleihen sicherzustellen. SDS-PAGE, Größe Ausgrenzung Chromatographie und Laser Multiwinkel Lichtstreuung sind Techniken häufig genutzt, um rekombinante Proteinqualität zu bewerten. Die Protein-Bibliothek ist dann auf Epoxysilane Dias gesichtet und bei-20 ° C für die langfristige Nutzung gespeichert. Proteinkonzentrationen oberhalb von 0,4 mg/mL sind für die nachfolgend beschriebenen Protokoll empfohlen. Daher erfordern niedrig exprimierenden Proteine einen Konzentration Schritt vor der Probe drucken und speichern. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist jedoch das geringe Volumen des Proteins erforderlich (50 μg des Proteins ist ausreichend, um ausführen > 2.000 Bildschirme), neben minimalen Abfrage Proteinkonsum (20-25 μg pro Duplikate Bildschirm). Mit dem Protokoll und Ausrüstung hier beschrieben und Bibliotheken zur Verfügung gestellt, können Ergebnisse für Einzelabfrage Proteine erzeugt werden, innerhalb eines Arbeitstages.

Eine große Herausforderung bei der Aufdeckung von Protein-Interaktionen in der extrazellulären Umgebung ergibt sich aus ihrer charakteristisch schwach oder vorübergehender Natur, die Identifizierung durch die am häufigsten verwendeten Methoden ausschließt. Erhöhung der verbindlichen Avidity stark verbessert Empfindlichkeit zur Erkennung von schwachen Protein Interaktionen9,10,11. Basierend auf diesem Prinzip wir entwickelten eine Methode, um Multimerize die Abfrage-Proteine (ausgedrückt als Fc Fusion) mit Protein A-beschichtete Perlen4,5. Um jede mögliche Inaktivierung des Abfrage-Proteins durch zufällige Kennzeichnung zu vermeiden, wir stattdessen eine irrelevante menschliche Immunglobulin G mit Cy5 beschriften und fügen Sie es zusammen mit dem Abfrage-Protein Protein A-Perlen, wodurch Artefakte aufgrund der direkten Konjugation von einem Färben Sie, das Protein des Interesses. Angesichts der mikromolaren Affinitäten von mehreren Paaren Ko-Rezeptor, verbessern die multivalente Anlagen stark Signal-Rausch-Verhältnis, im Vergleich zu Fc-Abfrage Fusionsproteine als lösliche Proteine4gezeigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen ist das Ziel dieses Protokolls, die Vorbereitung der Microarray-Folien mit einer vorbestehenden extrazelluläre Protein Bibliothek zur Identifizierung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu beschreiben. Wir überprüfen die Schritte für die Folie drucken, gefolgt von einem Protokoll für das Screening von einem Protein des Interesses gegen die extrazelluläre Protein-Bibliothek. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode für die erweiterte Erkennung von ePPIs basierend auf Microbeads erhöhte Avidität des Proteins unter Studie zu erreichen. Die hier beschriebenen extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie stellt einen schnellen, robusten und effektiven Ansatz für screening und Erkennung von neuartigen ePPI mit niedrige False-Positive-Verhältnisse und durch die einzige Mikrogramm Mengen des Proteins Abfrage unter Verwendung Untersuchung. Diese Technologie hat mehrere Studien angeheizt, die relevante Einblicke in bisher unbekannte Zellfunktionen und Signalwege für eine Vielzahl von Rezeptoren12,13, darunter virale Immunoregulators14zur Verfügung gestellt haben, und kann genutzt werden, um eine extrazelluläre Protein des Interesses de-orphanize.

Protocol

1. Generation aus einer Bibliothek von extrazellulären menschliche Proteine Stellen Sie eine Liste der Zelle Oberfläche Rezeptoren oder sekretierten Proteine des Interesses, die Protein-Microarray-Bibliothek zu bauen. Bestimmte Proteinfamilien (z. B. der Immunglobulin-Superfamilie) oder Proteine selektiv ausgedrückt insbesondere Zelle Arten für die Studie ausgewählt werden können. Bestimmen Sie für Oberfläche Zellrezeptoren die Domänengrenzen der extrazellulären (ECD) durch Ermittlung der Si…

Representative Results

Eine schematische Darstellung des Workflows für die extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie ist in Abbildung 1dargestellt. Sobald die Microarray-Folien mit der extrazelluläre Protein-Bibliothek zur Verfügung stehen, kann das Screening des Proteins des Interesses und Datenanalyse innerhalb eines Tages abgeschlossen werden. Viele physiologisch relevante Wechselwirkungen zwischen Membran eingebettet Rezeptoren zeichnen sich durch sehr schwache Bindung …

Discussion

Eine beträchtliche Anzahl von Orphan Rezeptoren bleiben im menschlichen Genom und neuartige interagierenden Partner weiterhin für die extrazellulären Proteine mit bisher charakterisierten Liganden entstehen. Festlegung der Rezeptor-Ligand-Interaktionen in der Human- und Modellorganismen ist wichtig zum Verständnis der Mechanismen, die zelluläre Kommunikation während der Homöostase sowie Dysregulation führt zu Krankheit zu bestimmen, und daher zu informieren, neue oder verbesserte therapeutische Optionen. Erkennun…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Philamer Calses und Kobe Yuen kritisch das Manuskript zu lesen. Wir sind dankbar für Randy Yen für gute technische Beratung.

Materials

Ultra Pure MB Grade glycerol USB Corporation 56-81-5 Protein storage
SeptoMark blocking buffer  Zeptosens BB1, 90-40 Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albumin Roche 03-117-957-001 Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell plates Greiner Bio One 82050-678 Protein storage
Polypropylene multiwell plates Arrayit MMP384 Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer Arrayit NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer Slide printing
Micro spotting pins Arrayit Micro spotting pins Slide printing
ZeptoFOG blocking station Zeptosens ZeptoFOG blocking station, 1210 Block slides after printing
Skim milk powder Thermo Fisher LP0031 Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slide Nextrion Slide E 1064016 Microarray slides
Glass holder and slide rack set Wheaton 900303 Slide storage
Cy5 monoreactive dye GE Healthcare PA23031 Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye GE Healthcare PA25001 Human IgG labeling
Pro-spin desalting column Princeton Separations CS-800 Remove free dye
Adhesive aluminum foil seal AlumaSeal F-384-100 Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vials Corning 430658 Master vials for protein library storage
Protein A microbeads Miltenyi 120-000-396 Query protein multimerization
Human IgG Jackson Immunoresearch  009-000-003 Irrelevant IgG for labeling
Protein A Sigma  P7837 Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similar Miltenyi Hybridization station, a-Hyb or similar Automated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similar Molecular Devices GenePix 4000B scanner or similar Slide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction software Molecular Devices GenePix Pro or equivalent data extraction software Data processing
Signal P4.1 DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark online software Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 server DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark online software Prediction of transmembrane helices in proteins
Phobius Stockholm Bioinformatics Center online software A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS Stockholm University online software Prediction of membrane topology and signal peptides

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Cite This Article
Husain, B., Paduchuri, S., Ramani, S. R., Martinez-Martin, N. Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58451, doi:10.3791/58451 (2019).

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