Her presenterer vi en protokoll til skjermen ekstracellulære protein microarrays for identifikasjon av romanen reseptor-ligand interaksjoner i høy gjennomstrømning. Vi har også beskriver en metode for å forbedre gjenkjenning av forbigående protein-protein interaksjoner ved hjelp av protein-microbead komplekser.
Utskilles faktorer, membran-bundet reseptorer og samarbeidspartnerne samhandlende viktigste regulatorer av mobil kommunikasjon og initiering signalnettverk cascades homeostase og sykdom, og representerer som førsteklasses terapeutiske mål. Til tross for deres relevans fortsatt disse samhandling nettverkene betydelig underrepresentert i gjeldende databaser; Derfor har mest ekstracellulære proteiner ingen dokumentert bindende partner. Dette avviket skyldes hovedsakelig utfordringene knyttet til studiet av de ekstracellulære proteinene, inkludert uttrykk for funksjonell proteiner og svakt, lav affinitet, protein interaksjoner ofte etablert mellom celleoverflaten reseptorer. Formålet med denne metoden er å beskrive utskrift av et bibliotek av ekstracellulære proteiner i et microarray format for screening av protein-protein interaksjoner. For å aktivere gjenkjenning av svake interaksjoner, er en metode basert på multimerization av spørringen protein under studien beskrevet. Koblet til denne microbead-baserte multimerization for økt multivalency, gir den protein microarray robust oppdaging av forbigående protein-protein interaksjoner i høy gjennomstrømning. Denne metoden tilbyr en rask og lav forbruker-tilnærming for identifisering av nye samhandlinger gjelder for alle ekstracellulære protein. Protein microarray utskrift og screening protokoll er beskrevet. Denne teknologien vil være nyttig for etterforskere søker en robust metode for oppdagelse av protein interaksjoner i ekstracellulære plass.
Metoden omtalt her beskriver utskrift av en samling av ekstracellulære proteiner i et microarray format, etterfulgt av en metode for screening av et mål av interesse mot dette biblioteket. Vi har identifisert protein multimerization som et viktig skritt for påvisning av interaksjoner preget av lav bindende slektskap. For å forbedre gjenkjenning av disse interaksjoner, beskriver vi en protokoll basert på multimerization av spørringen protein rundt ved hjelp av microbeads.
Skilles ut celle overflaten-uttrykt proteiner (kollektivt kalt ekstracellulære proteiner) sammen med samarbeidspartnerne samhandlende er viktige regulatorer av mobil kommunikasjon, signalisering og samspill med microenvironment. De er derfor viktige i å regulere mange fysiologiske og patologiske prosesser. Omtrent en fjerdedel av det menneskelige genomet (≈5, 000 proteiner) koder for ekstracellulære proteiner, som, gitt deres betydning og tilgjengelighet til systematisk leverte narkotika, representerer viktige mål for narkotika utvikling1. Følgelig representerer ekstracellulære proteiner mer enn 70% av protein mål med kjente farmakologisk handling for godkjente legemidler på markedet, kjent som “druggable proteom”. Til tross for deres betydning og overflod forblir den ekstracellulære protein-protein interaksjon (ePPI) nettverk bemerkelsesverdig underrepresentert i tilgjengelige databaser. Dette er fundamentalt komplekse biokjemiske innholdet i de ekstracellulære proteinene, som utelukker sin karakteristikk bruker mest tilgjengelige teknologier2. Først er membran proteiner vanskelig å solubilize, en prosess som involverer ofte harde vask forhold og vaskemidler; Dernest mangler ekstracellulære proteiner ofte relevante post-translasjonell modifikasjoner som glykosylering som er fraværende når disse proteinene er uttrykt i vanligvis brukt heterologous systemer. Til slutt, samspillet mellom reseptorer, som co reseptorer uttrykt på immunceller, er ofte midlertidig og preget av svært lav slektskap (KD i ~ 1 μM til > 100 μM utvalg). Sammen benyttet disse proteinene og deres bindende partnere gjengi mest teknologi, for eksempel rensing/massespektrometri med affinitet (AP/MS) eller gjær-to-hybrid, uegnet for påvisning av interaksjoner i ekstracellulære plass 2 , 3.
I et forsøk på å overvinne disse tekniske utfordringer og akselerere oppdagelsen av romanen samhandlinger for ekstracellulære proteiner, har vi utviklet en høy dekning ekstracellulære protein microarray4,5. Microarrays tilbyr fordelen av generere høy tetthet overflater med små mengder av prøven, og er generelt mottakelig for høy gjennomstrømning studier. Protein microarray-baserte studier har tidligere gitt relevant innsikt i protein interaksjoner for flere modell organismer, men hovedsakelig fokuserer på cytosolic interaksjoner eller bestemt protein familier6,7, 8. Sammenligning har begrenset arbeid blitt gjort for å undersøke ekstracellulære protein interaksjoner ved hjelp av denne teknologien. Vi har utviklet en protein microarray metode for å aktivere studier av ePPIs ved å bygge en omfattende og svært variert bibliotek av renset utskilles proteiner og enkelt transmembrane (STM) reseptorer uttrykt som rekombinant ekstracellulære domener (ECD) del felles koder for affinitet rensing4. Suksessen av protein microarray skjermene stoler tungt på etablering av et høykvalitets protein bibliotek. For uttrykk for både bibliotek og spørring protein, pattedyrceller eller insekt celler var preferentially valgt heterologous uttrykk systemer, å sikre riktig tillegg post-translasjonell modifikasjoner som glykosylering eller disulphide obligasjoner. SDS side, størrelse utelukkelse kromatografi og multivinkel laserlys spredning er teknikker vanligvis benyttes for å vurdere rekombinant protein kvalitet. Protein biblioteket deretter oppdaget på epoxysilane lysbilder og lagret på 20 ° C for langsiktig bruk. Protein konsentrasjoner over 0,4 mg/ml er anbefalt for protokollen beskrevet nedenfor. Derfor krever lav-uttrykke proteiner litt konsentrasjon før eksempel utskrift og lagring. Likevel en viktig nytte av denne teknikken er små volumet av protein kreves (50 μg protein er tilstrekkelig til å utføre > 2000 skjermer), sammen med minimal spørringen protein konsum (20-25 μg per duplikater skjermen). Ved hjelp av protokollen og utstyr beskrevet her, og bibliotekene er tilgjengelig, resultater for individuelle spørringen proteiner kan genereres innen én virkedag.
En stor utfordring i å oppdage protein interaksjoner i ekstracellulære miljøet oppstår fra deres karakteristisk svak eller forbigående Art, som utelukker identifikasjon av mest brukte metoder. Økende bindende avidity sterkt forbedrer følsomhet for gjenkjenning av svak protein interaksjoner9,10,11. Basert på dette prinsippet vi utviklet en metode for å multimerize spørring proteiner (uttrykt som Fc fusion) bruke protein A-belagt perler4,5. For å unngå noen potensielle inaktivering av spørringen protein ved tilfeldig merking, vi i stedet merke en irrelevante menneskelige immunglobulin G med Cy5 og legge den sammen med spørringen protein til protein A perler, dermed eliminere noen gjenstander på grunn av den direkte Bøyning av en fargestoff protein av interesse. Gitt de micromolar slektskap av flere co reseptor, forbedre multivalent komplekser kraftig signal til støyforhold, sammenlignet med Fc-fusion spørringen proteiner vist som løselig proteiner4.
Oppsummert er målet med denne protokollen til å beskrive utarbeidelse av microarray lysbilder som inneholder et eksisterende ekstracellulære protein bibliotek for identifikasjon av reseptor-ligand interaksjoner. Vi går gjennom trinnene for lysbildet utskrift, etterfulgt av en protokoll for screening av et protein av interesse mot ekstracellulære protein biblioteket. Videre beskriver vi en metode for bedre gjenkjenning av ePPIs basert på microbeads å oppnå økt avidity av proteinet under studien. Den ekstracellulære protein microarray teknologien beskrevet her representerer en rask, robust og effektiv tilnærming til screening og oppdage romanen ePPI med lav false-positiv forholdstall, og ved å bruke bare mikrogram mengder spørringen protein under gransking. Denne teknologien har drevet flere studier som har gitt relevant innsikt i tidligere ukjent cellulære funksjoner og signalnettverk trasé for en rekke reseptorer12,13, inkludert viral immunoregulators14, og kan brukes til å orphanize de alle ekstracellulære protein av interesse.
Et betydelig antall foreldreløs reseptorer beholdes i det menneskelige genomet, og romanen samspill partnere fortsette å dukke opp for ekstracellulære proteiner med tidligere preget ligander. Reseptor-ligand interaksjoner i human og modell organismer er viktig å forstå mekanismene som styrer mobil kommunikasjon homeostase, samt feilregulering fører til sykdom og derfor informere nye eller forbedrede behandlingsalternativer. Likevel har påvisning av ekstracellulære protein interaksjoner av brukte technologies repr…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Philamer Calses og Kobe Yuen for kritisk lesing manuskriptet. Vi er takknemlige til Randy Yen for gode tekniske råd.
Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |