Summary
여기 우리 성인 zebrafish (Danio rerio) DNA 기반 백신의 예방 접종에 대 한 프로토콜 설명 및 성공적인 예방 접종 이벤트의 유효성 검사를 보여 줍니다. 이 메서드는 다양 한 감염 모델 백신 후보자의 전 임상 검사에 적합 합니다.
Abstract
DNA 기반 예방 접종에 대 한 관심은 지난 2 년 동안 증가 했다. DNA 백신은 선택 된 항 원 또는 맞춤형 안전 디자인을 수 있게 하는 플라스 미드에 항 원의 조합 시퀀스의 복제에 기반. 호스트 세포로 DNA 백신의 관리 항 체액과 셀 중재 면역 반응을 자극 하는의 식을 이끌어 낸다. 이 보고서는 pCMV EGFP 플라스 미드, 섭취를 개선 하 여 근육 microinjection, 그리고 후속 electroporation 백신 후보자와 성인 zebrafish의 면역 항 원 시퀀스의 복제에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 백신 항 원 녹색 형광 단백질 (GFP)로 표현 됩니다-자외선 활 어와는 정량화 융해 단백질의 표현 레벨의 ELISA와로 항 원 식의 확인 수 있는 융합 단백질 서쪽 오 점 분석 그들의 탐지입니다. 진 균 marinum 오 주 postvaccination 물고기를 감염에 의해 백신 후보자의 보호 효과 테스트는 정량으로 박테리아의 정량화 뒤 4 주 후. 포유류 전 임상 심사 모델에 비해,이 메서드를 mycobacterial 감염에 대 한 새로운 DNA 기반 백신 후보자의 예비 심사에 대 한 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 다양 한 세균성과 바이러스 성 질병에 대 한 DNA 기반 백신 검사에 추가 적용할 수 있습니다.
Introduction
19901에서 첫 번째 DNA 백신 연구 수행 하 고 그 이후, DNA 백신 다양 한 전염 성 질환, 암, 면역, 알레르기2에 대 한 테스트 되었습니다. 포유류에서 말에서 웨스트 나 일 바이러스에 대 한 DNA 백신과 개 구두 흑색 종에 대 한 치료 암 백신 허가 되었습니다, 하지만 이들은 현재 임상 사용2. 포유류 연구에 의해 갖는 관심 뿐만 아니라 DNA 백신은 밝혀졌다 밖으로 바이러스 성 질병에 대 한 물고기 농장된을 면역 하는 편리한 방법을. 그리고 전염 성 췌 장 괴 사 바이러스 (IPNV)에 대 한 백신은 최근 면허3물고기 전염 성 조 혈 괴 사 바이러스 (IHNV)에 대 한 백신 2005 년부터, 상업적인 사용에서 되었습니다. 또한, 물고기 병원 균에 대 한 몇 가지 DNA 백신 개발 되고있다.
전통적인 백신 사 또는 라이브 감쇠 병원 체 포함 하는 자주, 그들은 질병2전송의 잠재적인 위험을 내포 하 고. DNA 백신, 차례 차례로, 그들은 전체 병원 체 자체 보다는 세균성 또는 바이러스 성 항 원,2,4인코딩 하는 플라스 미드의 관리를 기반으로이 위험을 막기. DNA 백신은 단일 백신 구성5백신 항 원의 정확한 디자인 및 항 원 조합 adjuvants의 유연한 공식화 수 있는 DNA 재조합 기술로 생산 됩니다. 또한, DNA 백신의 생산은 빠르고, 더 쉽고 비용-효율적 단백질 기반 재조합 백신, 백신 후보 심사 목적 뿐만 아니라, 예를 들면, 유행 성 감염의 경우 주요 장점은 보다 2.
물고기, DNA 백신에 대 한 가장 일반적인 관리 경로 복, 근육, 및 구두3,6,7, 포유류, 피하에 있으며 피부 경로 추가 옵션2. 근육 주사 후 관리 되 DNA 플라스 미드 입력 관리 사이트에서 셀 (예., 주로 myocytes, 뿐만 아니라 주민 항 원 제시 세포 [Apc]). Electroporation2,8transfected 세포의 비율을 크게 늘릴 수 있습니다. 셀을 입력 한 후 일부 플라스 미드 DNA 플라스 미드에 의해 유전자는 베 껴 진된2는 핵에 들어간다. 이 프로토콜에서 우리는 진 핵 식9에 최적화 된 강력한 유비 쿼터 스 발기인 pCMV EGFP 플라스 미드를 이용 한다. 이 구문에서 항 원은 GFP 융해 단백질으로 변환 됩니다. GFP는 활 어에 형광 현미경으로 항 원 식의 간단한 시각화 하 여 성공적인 예방 접종과 정확한 항 원 제품의 확인을 수 있습니다.
포유류에서 DNA 백신 자극 transfected 세포 유형2,5에 따라 면역 반응의 종류를 표시 되었습니다. Transfected myocytes 세포 외 공간으로 항 원 분 비 또는 세포 죽음에, 해제 하 고 APCs에 의해 잠겼습니다 하는 항 원, 이후, 중요 한 조직 적합성 복잡 한 II 분자2. 이 B 세포 응답2,,510이외에 특히, c d 4와 CD8 T 세포 응답을 트리거합니다. 물고기, T와 B 세포로 수지상 세포 (DCs), 확인 된, 아직 항 프레 젠 테이 션에 그들의 분업은 더 적은 잘 이해11. 그러나 Zebrafish Dc,, 그들의 포유류 대응12보존된 phenotypic 및 기능적 특성을 공유 하는 표시 되었습니다. 또한, DNA 백신은 물고기와 포유류, T와 B 세포 응답6,13,,1415,16 포함 하 여 유사한 면역 반응을 유도 하 보였다 .
애벌레와 성인 zebrafish 모델 다른 전염병, 결핵이 프로토콜17,,1819,20에서에서 사용의 물고기 M. marinum 감염 모델 등을 널리 이용 된다 ,,2122. 포유류 모형 유기 체, 비교 zebrafish의 장점은 그들의 작은 크기, 빠른 재현성를 포함 하 고 낮은 비용23주택. 이러한 측면에서 zebrafish 소설 백신과 제약 화합물23,,2425에 대 한 대규모 전 임상 스크리닝 연구를 위한 이상적인 동물 모델을 확인합니다.
이 프로토콜에서 우리는 어떻게 새로운 백신 항 원 성인 zebrafish의 DNA를 기반으로 하는 예방 접종에 의해 mycobacteriosis에 대 한 후보자를 평가할 수 있습니다 설명 합니다. 첫째, 우리는 항 pCMV EGFP 식 플라스 미드, 근육에 백신 플라스 미드 및 후속 electroporation 근육 주사에 대 한 자세한 프로토콜 뒤에 복제 되는 방법을 설명 합니다. 각 항의 식은 형광 현미경 일주일 postimmunization에 의해 확인 된다. 항 원 후보자의 효능은 다음 M. marinum와 예방 접종된 물고기를 실험적으로 감염에 의해 테스트 됩니다.
Protocol
실험 성인 zebrafish를 포함 하 여 모두는 예방 접종과 감염 모델 후속 연구에 대 한 동물 실험에 대 한 사용 권한이 필요 합니다. 모든 메서드 및 여기에 설명 된 실험 핀란드 동물 실험 보드 (ESAVI)에 의해 승인 되 고 연구 EU 지침 2010/63/EU에 따라 수행 됩니다.
1. DNA 백신 항 원의 복제
- 한 식 플라스 미드 진 핵 세포 (CMV) 즉시 초기 발기인 등 강한, 제정 발기인에서 관심의 antigen(s) 표현에 대 한 최적화를 선택 합니다. 항 원 식의 비보에 확인을 사용 하려면이 프로토콜에 사용 된 pCMV EGFP 플라스 미드9 같은 형광 태그를 인코딩하는 백신 플라스 미드를 선택 합니다.
- 적절 한 웹 기반 및 bioinformatic 도구를 사용 하 여는 gene(s)에서 잠재적으로 면역 보호 항 순서 (또는 여러 시퀀스) 약 90-600 nt (30-200 aa)26 의 선택-의-에서 사용 될 것 이다 병원 체의 관심은 이후 감염 모델입니다.
- 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하거나 수동으로 병원 체 게놈에서 항 원 유전자를 증폭 하 고 항 원 애 식 플라스 미드의 다중 복제 사이트에 복제 하는 뇌관 디자인. 항을 선택할 때 올바른 독서 프레임을 유지 되었는지 확인 합니다.
- 5' 뇌관에 Kozak 시퀀스 (CCACC)27 와 시작 codon (ATG)를 포함 합니다. C-터미널 EGFP 태그를 유지 하려면 항 원 시퀀스 및 3 개의 ' 뇌관에 중간 정지 codons를 (태그, TAA, TGA)를 하지 마십시오. 또한, GFP 태그의 항 원과 동일한 독서 프레임에 남아 확인 합니다.
- RNA 또는 DNA 템플렛으로 병원 체에서 추출에 사용 하 여 복제 한 뇌관으로 PCR 제품의 적절 한 금액을 생성. 가급적, 교정의 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 정확한 항 원 순서를 유지 하기 위해.
- PCR 제품을 정화 하 고 젤 전기 이동 법에 의해 제품의 정확한 크기를 확인 합니다. 소화 하 고 소화 백신 플라스 미드 PCR 제품 선.
- 적합 한 프로토콜에 따라 유능한 박테리아 세포에 결 찰 믹스 변환. 긍정적인 식민지 및 플라스 미드 생산 대장균;에 적절 한 항생제 선택 사용 pCMV EGFP 플라스 미드, 예를 들어이 암 피 실린 저항 유전자를 포함합니다.
- 생어를 사용 하 여 올바른 항 시퀀스의 삽입을 확인 하는 순서. 다음 프라이 머 pCMV EGFP 플라스 미드 항 원 시퀀싱에 사용 될 수 있습니다: CMV 전달 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 '와 EGFP N 역방향 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'.
- 생산 하 고 충분 한 양의 백신 구문 정화. 해산 또는 살 균 물에 플라스 미드 elute. 생산된 플라스 미드 DNA 높은 품질의 고 농도 적어도 0.72 µ M 또는 2000 ng / µ L 다는 것을 확인 하십시오.
2. 당기 Microinjection 바늘
- Microinjection 바늘을 사전에 준비 합니다. 10 cm aluminosilicate 유리 모 세관을 사용 합니다. 붕 규 산 유리 모 세관 성인 물고기를 주입에 대 한도 취는 note.
- Micropipette 바늘 조작 장치 바늘을 당겨.
참고: 바늘 비슷할 그림 1에서 제시 하는 것입니다. 이 프로토콜 (자료 테이블)에 사용 되는 장치는 다음 설정을 원하는 종류의 바늘의 결과:- 끌어당기는 바에서 유리 V 홈에 모 세관을 설정 하 고 가볍게 클램핑 노브를 조입니다.
- 필 라 멘 옆에 홀더를 이동 하 고 부드럽게 끌어당기는 바에는 필 라 멘 트의 반대편에는 필 라 멘 트를 통해 모 세관을 밀어. 모 세관으로 필 라 멘 트를 만지지 마십시오.
- 클램핑 손잡이 강화 안전 유리 아래로 설정 하 고 끌어오기 단추를 누릅니다.
주의: 필 라 멘이 뜨겁다.
- 바늘 바늘 팁을 보호 하기 위해 15 cm 배양 접시 플레이트 내부 재사용 접착제의 조각에 놓습니다. 접시를 깨끗 하 게 유지 바늘 덮여 유지.
3. 작성 Micropipette 바늘
- 백신 믹스를 준비 합니다. 복용량 당 플라스 미드의 0.5-12 µ g를 사용 합니다. 결합 한 접종 믹스에 여러 다른 플라스 미드, 물고기 당 12 µ g의 최대 총 DNA 농도 사용 합니다.
- "마스터 믹스" 물고기의 수에 따라 각 그룹 (아래 참조)에 백신의 볼륨을 계산 합니다. 모두 모 세관 바늘의 충전 및 주입의 관찰을 쉽게 하기 위해 각 주입 복용량에 살 균 된 페 놀 레드의 1 µ l를 추가 합니다. 살 균 1 추가 한 주입 복용량8µ l 5-7의 최대 총 볼륨까지 PBS x.
참고: 사출 볼륨 7 µ L 보다 더 높은 주입 솔루션의 가끔 누설 될 수 있습니다 및 따라서 피해 야 한다. - 테이프, 접착제 쪽, 적절 한 홀더, 예를 들어 빈 팁 상자의 측면에 조각을 넣으십시오. 부드럽게 테이프를 모 세관 바늘을 연결 합니다.
- 피펫으로 실험실 영화의 조각에 백신 믹스의 7 µ L의 최대. 로드 팁을 사용 하 여, 바늘에 영화에서 백신 전송. 피펫으로 천천히 그리고 신중 하 게, 바늘을 pipetting 공기 방울을 피하십시오.
- 15-30 분 가능한 나머지 작은 공기 방울을 제거에 대 한 정착 바늘을 하자.
4. 예방 접종에 대 한 Microinjector 및 Electroporator 설정
- 적당 한 위치에는 micromanipulator 및 광원을 설정 합니다. 오픈 위치에 공기 압력 탭을 전환 합니다.
- 공기에 대 한 매개 변수를 조정 펌프 다음과 같습니다 ( 그림 2참조).
- 모 세관 작용에 의해 피펫으로 백필 방지 하기 위해 개최 추출 포트 에 환기 노브를 설정 합니다. 배출 포트에서는 micropipette 튜브 를 설정 합니다. 이 프로토콜에서 진공 포트를 사용 하지 마십시오.
- 펄스 길이조정: 사용 하 여 타임 모드는, 전자 타이머 압력 솔레노이드 열린 상태를 유지 하는 시간의 기간을 제어. 배출 압력 게이지 옆 녹색 램프 점등 압력 솔레노이드 (활력)을 열 때 확인 합니다.
- 10 펄스 범위 설정 s; 이 설정을 사용 하 여 펄스 설정할 수 있습니다 더 100 ms에서 10.1 미 사용 하는 10-회전 기간 다이얼 펄스 길이 미세 조정에 대 한-전화의 모든 차례는 1.0 s. 필요한 경우,이 또한 주사 동안 조정할 수 있습니다.
- 공 압 펌프, 또는 한 원격 발 스위치 (권장)의 전면 패널에 펄스 초기자 ("시작 버튼")를 사용 합니다. 이것은 공 압 펌프의 전면 패널에 연결 된다.
- micromanipulator micropipette 보유자에 바늘을 설정 합니다. 액체, 밀릴 수 있다 하 고 현미경을 사용 하 여 정확한 위치를 볼 수 있도록 핀셋으로 바늘의 끝을 잘라. 1-s 펄스 바늘에서 작은 방울을 밀어 보고 발 스위치를 한 번 누릅니다.
- 다음 설정을 사용 하 여 electroporator에 대 한: 전압 = 40 V; 펄스 길이 50 ms, 펄스의 수를 = = 6. 족집게는 electroporator에 연결 합니다. 그는 실제 전압 및 펄스 길이 모니터에 표시 된 차이가 없습니다 크게 설정에서 참조 하십시오.
5. DNA 백신 및 Electroporation의 주입
- 이 프로토콜을 사용 건강, 6 12 달 오래 된 성인 zebrafish에 따르면 예방 접종. 물 1 L 당 7 물고기의 최대 14/10 h 명암 주기 흐름을 통해 시스템에서 물고기를 유지.
- 물고기28마비는 0.02 %3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (tricaine) 솔루션 (pH 7) 물 탱크에서에서 준비. 사용 하 여 10 cm 배양 접시 또는 이와 유사한.
- 깨끗 한 시스템 물 3 l 5 L 비 커를 작성 하 여 복구 탱크를 준비 합니다.
- 예방 접종 예방 접종 기간 동안 고정된 위치에서 물고기를 계속 패딩 준비. 3 cm 두꺼운 스폰지 2의 5 x 7 cm2 조각 가져가 라. 스폰지에 메스 블레이드와 함께 하는 홈 잘라 또는 날카로운가 위.
참고: 동일한 예방 접종 패딩 여러 실험에 사용할 수 있습니다. 70% 에틸 알코올에 몸을 담글 하 여 실험 사이 스폰지를 소독 하 고 건조를 허용 합니다. - 철저 하 게 시스템 물에 스폰지를 적시 게 하 고 페 트리 접시에 스폰지를 설정 합니다.
- 빠른 물고기는 예방 접종 하기 전에 24 시간입니다.
- 0.02 %tricaine 포함 하는 배양 접시에 그것을 배치 하 여 한 제 브라를 anesthetize. 물고기 터치 자극에 응답 하지 않는 때까지 그리고 아가미의 운동 될 때까지 기다립니다. 한 번에 하나의 물고기를 anesthetize.
- 플라스틱 숟가락을 사용 하 여, 젖은 스폰지에 마 취 제 브라를 전송 하 고 홈으로 물고기의 복 부 측을 설정 합니다. 올바른 위치에 머리와 물고기의 시체의 대부분은 홈 내부와 지 느 러 미와 꼬리는 홈에서 밖으로 튀어나와 확인 합니다.
- 현미경, 신중 하 게 바늘에 배치를 사용 하는 x 축 및 y 축 미세 zebrafish의 등 쪽 근육에 가까운 약 45 ° 각도 micromanipulator에 바퀴.
- 어디에 바늘을 밀어 요구 하지 않는다 힘 느, 앞 저울 없이 작은 자리를 찾아. 저항을 느꼈다는 인접 한 자리를 보십시오. 척추, 느, 또는 비늘 부상 하지 마십시오.
참고: 바늘 밀고 있는 동안 굴절, 줄일 바늘 약간 그것을 절단 하 여. - 발 스위치를 사용 하 여 점차적으로 근육에 주입 백신 솔루션을. 주사 현미경을 통해 관찰: 그것은 근육 조직으로 페 놀 레드 표시 됩니다. 필요한 경우 펄스의 지속 시간을 조정 합니다.
참고: 또는 주입을 위해 공 압 펌프의 전면 패널에 펄스 초기자 버튼을 사용 합니다. 그러나, 원격 발 스위치를 사용 하 여를 10-회전 다이얼 바퀴에 의해 펄스 길이 조정 하기 위해 다른 손을 사용 하 수 있습니다. 이 과도 한 조직 손상 될 수 있으므로 너무 빨리 솔루션을 주입 하지 마십시오. 공기 주입을 하지 있는지 확인 합니다. - Electroporate 주사 후 즉시 물고기입니다. 물고기 마 취의 밑에 아직도 있는지 확인 합니다. 스펀지에 물고기를 유지 하 고 족집게 형 전극 사이 물고기를 설정 하 전극 주사 사이트의 각 측면에 있습니다. 누르지 마십시오 전극 핀셋 너무 빡 빡 하지만 물고기를 접촉 하 여 두 전극.
- 6 40 V, 50 ms 펄스를 주고 electroporator에서 시작 버튼을 누릅니다.
- 부드럽게 복구 탱크에 물고기를 전송 합니다.
- 70% 에탄올과 그들을 강타해 각 electroporation 후 전극을 청소.
참고: 신중 하 게 접종 후 물고기의 모니터링 합니다. 불편의 어떤 물고기를 안락사 (마 취, 탈에서 느린 회복 수영, 허 걱) 0.04 %tricaine. 복구 후 물고기 흐름을 통해 장치에 전송 하 고 일반적으로 그것을 피드.
6. 시각화 및 항 원 식의 영상
- Anesthetize 0.02 %tricaine 물고기, 예방 접종 후 2-7 일 고 UV 빛을 사용 하 여 사출 사이트 근처 EGFP 식을 참조 하십시오.
참고: UV 빛 아래에서 검사 또한 대규모 실험에서 성공적인 예방 접종의 일상적인 확인 적합 쉽고 비-침략 적 작업입니다. 물고기의 이미지가 필요한 경우이 단계는 anesthetize 또는 물고기를 이동 하는 필요 없이 일반 어항에도 수행할 수 있습니다. - 이미지를 캡처하려면 형광 현미경을 사용 하 여 사출 사이트8EGFP 식 시각화. 2 X 객관적 렌즈를 사용 하 고 올바른 필터 형광 또는 보이는 빛 보기 시각화를 선택 합니다.
- 페 트리 접시 바닥을 향해 핀셋으로 복 부의 지 느 러 미를 부드럽게 눌러 의해 아직도 마 취 물고기를 유지. 같은 영역의 빛-현미경 및 형광 이미지를 가져가 라.
- 29적절 한 소프트웨어 사용 하 여 빛-현미경 및 형광 이미지를 병합 합니다. 눈금 막대를 추가 합니다.
7. 식 수준 및 항 원의 크기의 정량화
- 0.04 %tricaine 물고기 안락사 메스와 UV 빛에서 핀셋 등 쪽 근육의 형광 부분 해 부. 샘플8에서 단백질을 추출 합니다.
- Vivo에서의 정확한 크기를 확인 하십시오-서쪽 오 점 분석, 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 사용 하 여 단백질을 생산-활용된 GFP 항 체 (또는 유사한)8. 융합된 항 원 없이 어떤 배경 신호 표현 EGFP 컨트롤과 함께 난다 바인딩 제외 부정적인 제어 (unimmunized 물고기)를 포함 합니다.
참고: 서쪽 오 점 분석에 대 한 예상된 크기 (kDa) 항 원-융해 단백질의 산출 될 수 있다, 예를 들어 수식으로:
DsDNA의 분자량 (MW) = (607.4 x 뉴클레오티드의 수) + 157.9; 또는 웹 기반 도구를 사용 하 여. - GFP ELISA8 (선택 사항)을 사용 하 여 각 항의 식을 계량.
8. 예방 접종 프로토콜 M. marinum 감염 모델 결합
- 새로운 백신 후보 감염 모델에 사용 하는 분석 결과의 효과의 신뢰할 수 있는 결정에 필요한 그룹 크기 결정 (참조, 예를 들어 Myllymaki 외. 24 Charan 및 Kantharia30). 실험을 계획 하는 동안 적절 한 전원 계산을 실시 합니다.
- 백신의 효과 평가 하려면 물고기 5 주 postimmunization 감염. 약 30 식민지 형성 단위 (cfu) M. marinum, 대부분에서 잠재성 감염으로 이끌어 물고기8,,2031복 감염을 사용 합니다.
주: M. marinum를 사용할 때 BSL2 안전 프로토콜을 따릅니다. 박테리아 나 바이러스의 준비는 병원 체에 따라 달라 집니다. - 각 물고기에 병원 균의 수를 계량. 물고기 4 주 바람직합니다 안락사 고 정량 Pcr 뇌관 특정 M. marinum20,24를 사용 하 여 함께 각 생선에서 추출 된 DNA에 세균성 부담을 결정 합니다.
참고: 적절 한 관리 그룹을 포함 하 고 결과 분석 하기 위한 올바른 통계 방법을 사용 해야 합니다. 일반적으로, 생선 빈 pCMV-EGFP 플라스 미드 접종의 그룹 적합 한 부정적인 제어 이다. - GFP 태그 없이 항 원 긍정적인 결과 확인 합니다. 단계 1에서에서 설명한 대로 항 원 복제 하 고 예방 접종 실험을 반복 합니다.
Representative Results
성인 zebrafish의 DNA 백신 프로토콜에 관련 된 단계는 그림 3에서 설명 됩니다. 처음으로, 선택 된 항 원 시퀀스 pCMV EGFP 플라스 미드로 복제 되 고 플라스 미드 DNA 생산과 정화24 (그림 3). 백신 후보자는 다음 주사 피하는 microinjector 이며 주사 부 셀 (그림 3)에 플라스 미드의 섭취를 개선 하기 위해 electroporated. 사용 된 백신 주사 복용량 pCMV EGFP 플라스 미드의 다른 양의 주입 GFP 식을 ELISA (보 그림 1)을 측정 하 여 최적화 되었다. 2 7 일 postvaccination, 융해 단백질의 표정 UV 빛에서 감지 하 고 형광 현미경 검사 법 (그림 3 및 그림 4)와 시각. 다른 항 원의 식 레벨에서 매우 달라질 수 있습니다 (그림 4) 희미 한 식 집중 (1 항). 또한, GFP 식 등 근육 (1 항), 또는 더 제한 된 영역 (2 항)에서 관찰 될 수 있다 (그림 4). 그러나, 아무 형광 감지 되 면 10 일 이내에, 그것 항 복제 또는 뇌관 디자인에서 실수는 다는 것을 확인 하 고 좋습니다. 표현된 융해 단백질의 정확한 크기는 것인지 단백질 사출 사이트 주위 근육 조직에서 추출한 고 서쪽 오 점 분석에 사용 될 수 있습니다.
백신의 효과 복 주사 (그림 5)에 의해 M. marinum 의 낮은 복용량과 함께 물고기를 도전 하 여 평가 됩니다. 4 ~ 5 주 바람직합니다, 세균 수 정량으로 결정 하 고 제어 그룹 (그림 5)에서 세균 중에 비해. 또한, 높은 복용량(그림 5 M. marinum 감염 후 생존을 모니터링 하 여 가장 유망한 백신 후보자의 효과 테스트할 수 있습니다). 그러나, 살아있는 또는 죽은, 단지 상태 대신 감염의 진행에 양적 결과 주는 외에 정량 기반 cfu 정량화 적은 시간을 요구 한다 작은 그룹 크기와 이다, 따라서, 기본에 대 한 더 많은 윤리적인 접근 화면입니다. 전반적으로,이 프로토콜은 12 주 (그림 5) 이내 새로운 백신 항 원 효과의 심사를 촉진 한다.
그림 1: 클로즈업 (12) 성인 zebrafish 근육 내 주사에 사용 된 aluminosilicate 바늘의. 아래 팁 핀셋으로 잘라 왔다 이며 microinjections에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 그림은 Oksanen35에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Microinjection 장비 및 설정. 성인 zebrafish의 DNA 백신 접종에 필요한 장비의 주요 구성 요소는 굵게 강조 표시 됩니다. 중요 한 조정 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: DNA 백신 플라스 미드 및 예방 접종 절차를 준비. (1) 선택한 항 옆 pCMV-EGFP 플라스 미드에 GFP 태그에 복제 됩니다. (2) 백신 구조는 미생물학, 집중, 생산과 정화. 플라스 미드의 µ g (3) 12는 microinjector와 마 취 성인 zebrafish의 등 쪽 근육에 주입 그리고 주입 사이트 이후에 6 40-V, 50-ms 펄스와 electroporated. (4) 2 ~ 7 일 postvaccination, 항 원-GFP 융해 단백질의 GFP 식 형광 현미경 시각 이다. (5)는 형광 부분 등 쪽 근육의 해 부 고 단백질 추출에 사용 될 수 있습니다. 융해 단백질의 크기는 서쪽 오 점 분석 및 GFP ELISA와 식 수준으로 확인 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 시각화 항 EGFP 융해 단백질의 표정. 마 취 성인 zebrafish 실험 백신 항 원 (항 원 1-3)의 12 µ g와 예방 접종 이며 사출 사이트 electroporated, 그 후, 6 40 V, 50 ms 펄스. 2 7 일 postvaccination, 사출 사이트 현미경으로 몇 군데입니다. 첫째, GFP의 식 형광 현미경에서 검출 된다. 2 X 크기 목표를 사용 하 여 몇 군데 있고.tiff 형태로 저장 영역 검사 합니다. 같은 영역의 빛 현미경 이미지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지와 병합 됩니다. 수량 및 항 원 식의 위치는 항 원 및 개별 물고기 사이 달라질 수 있습니다. 예를 들어 항 1의 표현 등 근육에 걸쳐 관찰과 항 3은 더 제한 된 지역에서 강력 하 게 표현 하는 반면 항 2의 식 작은 반점으로 보인다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: mycobacterial 감염에 대 한 백신 후보자의 효과 테스트. (1) 성인 zebrafish는 mycobacteriosis에 대 한 실험적인 DNA 백신으로 예방 접종. (2) 5 주 postvaccination를 물고기에 감염 된 진 균 marinum (~ 30 cfu)의 낮은 복용량. (3) 4 주 후, 내부 기관 해 부 이며 DNA 추출에 사용. (4) 각 물고기에 세균 수와 M. marinum를 사용 하 여 정량 계량-특정 뇌관. 면역 항 원과 1 항 2, 3 동안 세균 수 (p < 0.01, 양방향 ANOVA)에 상당한 감소를 주도 했다 영향을 주지 않습니다. 가장 유망한 백신 후보 (1 항)에의 (5) 보호 효과 생존 실험, 물고기에 감염 된 박테리아의 높은 복용량 (~ 10000 cfu) 및 그들의 생존은 12 주 동안 모니터링에 더 계산 됩니다. 세균성 부담 감소와 일치 관찰, 패널 4, 항 1과 예방 접종 또한 향상 M. marinum 감염 시 물고기의 생존 (p < 0.01), 유망 수이 항 원 제시 결핵에 대 한 새로운 백신에 대 한 후보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 플라스 미드 DNA의 금액에 영향을 미치는 성인 zebrafish의 플라스 미드 파생 EGFP 식. 물고기의 그룹 (n = 각 그룹에서 5) pCMV-EGFP의 0.5-20 μ g 주입 했다 electroporation 50 V의 (6 펄스)는 transfection를 향상 시키기 위해 사용 되었다. 제어 물고기 (CTRL) EGFP 유전자를 포함 하지 않는 빈 pCMV 플라스 미드의 2 μ g을 주입 했다. GFP ELISA 물고기 homogenates에 상대적인 EGFP 식 정의 수행된 3 일 postinjection 했다. P-값: *p < 0.03, * *p < 0.004. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. NS = 중요 한. 이 그림은 Oksanen35에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
성인 zebrafish DNA 기반 백신과 면역의 절차는 약간의 기술적인 전문 지식을 필요 합니다. 심지어 숙련 된 연구원에 대 한 단일 물고기에 우 두를 접종 준비를 제외 하 고 약 3 분 걸립니다. 따라서, 최대 약 100 물고기 하루는 예방 접종 수 있습니다. 100 이상의 물고기 실험을 위해 필요한 경우, 최대 3 일 사이 예방접종을 나눌 수 있습니다. 실험의 품질 뿐만 아니라 물고기를 처리 하 고 예방 접종을 수행에 대 한 researcher(s)의 충분 한 훈련 물고기의 복지를 위해 필수적 이다. 주택 계획, 실험 및 실험을 수행 하는 인력에 필요한 자격, 물고기에 올 때 현지 법률 및 동물 복지 규칙 및 지침에 따라 확인 하십시오.
요약 하자면, 예방 접종 프로토콜에서 합병증을 피하기 위해 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 성공적인 예방 접종에 대 한 있도록 1) 물고기 예방 접종 수 있는 건강 하 고 충분 한 나이 및 크기 (더 젊은 물고기의 예방접종 백신 볼륨과 electroporation 설정 다운 스케일링 필요할 수 있습니다); 2) 물고기 제대로 없이 마 취 0.02 %3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르, 보다 더 강한 그들은 남아 전체 절차를 통해 마 취 (마 취 유지 되어야 한다 물고기의 복구를 보장 하기 위해 가능한 한 짧게); 3) 스펀지 패드는 제대로 젖 었; 4) 공 압 펌프에서 각 펄스에 액체를 주입 하 고, 펄스 길이 조정 하지 않을 경우 (y 축 따라 약간 뒤로 바늘을 당겨 도울 수 있다); 5) 백신 솔루션; 없는 기포는 6) electroporation 설정과 실제 펄스 전압 및 길이 옳다; 7) 전극 (electroporation, 계속 부드러운에 전극 접촉 물고기, electroporation 후 즉시 복구 탱크에 물고기를 풀어) 동안 피부 손상을 electroporation 사이트에 발생 하지 않습니다.
복구 탱크에 electroporation 후 물고기를 모니터링 하 고 불편의 어떤 물고기를 안락사 중요 하다. 또한, 그것은 유창한 워크플로 위해 대규모 실험을 시작 하기 전에 절차를 연습 하는 데 필요한입니다. 만약에 가능 하다 면, 충분히 훈련 된 동료는 바늘과는 electroporation 작성 지원 요청.
DNA 백신 접종 방법 백신 항 원의 맞춤형 디자인을 수 있습니다. 전체 항 복제 또는, 선호, 셀룰러 현지화 및 immunogenicity24에 따라 항 원의 부품 선택이 가능 하다. 또한, 메서드는 한 백신 구성으로 여러 가지 항 원 또는 adjuvants 결합 또는 같은 시간2에 여러 별도 플라스 미드를 주입 수 있습니다. 항 원 시퀀스 후 정지 codon를 포함 하 여 또는 플라스 미드에서 EGFP 유전자를 절 개 하 여, 후속 N 맨끝 GFP 태그 없이 항 원 표현 하는 또한 같은 플라스 미드 벡터 활용 가능 하다. GFP의 비교적 큰 크기 수 항의 폴딩에 영향을 하 고, 따라서, 잠재적으로 예방 접종에 의해 evoked 체액 응답을 제한 긍정적인 심사 결과 확인에서 적당 한 수 있습니다.
높은 항 원 식 DNA 백신 immunogenicity2에 연결 되었습니다. 주입 후 Electroporation, 따라서에 포함 되었습니다이 프로토콜 사중 항 원 또는에서 리포터 유전자의 표정을 증가 표시 되었습니다로 zebrafish32에 열 배. 또한, electroporation 기법으로 적당 한 조직 부상, 따라서 추가 백신 유도 면역 반응2촉진 지역의 염증 유도 하면 됩니다. 다른 한편으로, electroporation 일반적으로 잘 용납입니다. 여기에 사용 되는 장비와 실질적으로 성인 zebrafish의 100%는 40이 프로토콜35에 사용 된 V 6 펄스에서 잘 회복 됩니다.
Electroporation를 사용 하 여 셀에 백신 플라스 미드의 항목을 향상 시키기 위해, 우리 물고기 transfected 세포에 항 원 식을 항의 3' 끝에 백신 플라스 미드와 polyA 꼬리에 강한 유비 쿼터 스 모터 사용. 경우에 따라 대상 병원 체의 codon 사용법 예방 접종된 종 크게 다른 경우 코 돈 최적화 발견 되었습니다 대상 유전자 식2를 더 증가 하는 데 유용. 그러나 코 돈 최적화 두 mycobacterial 모델 유전자, ESAT-6 및 c f P-10 의 식 수준에 더 큰 영향을 했다 그리고이 모델35에에서 불필요 한 간주 되었다, 따라서,,이 제 브라-M. marinum 모델에서 .
대상 유전자 식 프로필, 예를 들어, 크기와 항 원에의 구조에 따라 항 원 사이 일시적인 일부 유사가 있다. 그러나, 항 원 식 물고기 같은 백신 접종의 그룹 내에서 일반적으로 비슷합니다. 일반적으로, 밝은 EGFP 식 일주일 postvaccination, 4 일 관찰 하지만 2-10 일의 스케일 가능 합니다. 항을 포함 하 여 대규모 실험에서 전에 물고기 (2-3)의 작은 그룹에서 각 항 EGFP 융해 단백질의 식을 확인 하는 것이 좋습니다. GFP 식이 없는 언제 든 지 접종 후 2-10 일, 관찰 하는 경우 1) 예방 접종 프로토콜 신중 하 게 그 뒤를 이었다. 항상 긍정적인 제어로 빈 pCMV-EGFP 플라스 미드 접종 물고기의 그룹이 고 있는지 2) 항 원 디자인 및 분자 클로닝 실시 되었다 제대로 (적절 한 뇌관; 항 디자인과 EGFP 태그는 모두 같은 독서 프레임 없음 중간 정지 codons 포함 됩니다). 정확한 항 원 디자인에도 불구 하 고 어떤 경우에 GFP은 감지할 수 없습니다. 이 잘못 된 접는 또는 융해 단백질의 급속 한 붕괴 원인일 수 있습니다. 이러한 상황에서 그것은 항을 재설계 해야 합니다.
물고기 농장된을 면역 하는 데 사용 되는 백신에 사용 하는 플라스 미드 복용량은 일반적으로 1 µ g 또는 더 적은7,,3334. Zebrafish에서 리포터 유전자 발현도 검출 될 수 있다 electroporation; 다음 적어도 0.5 µ g 플라스 미드 주입 후 그러나, 상대 대상 유전자 발현 물고기 (보충 그림 1) 당 플라스 미드의 더 높은 금액으로 크게 증가합니다. PCMV EGFP 기자 플라스 미드와 함께 주입 하는 물고기에서 플라스 미드의 5-20 µ g 주사 결과 4 ~ 8 배 높은 EGFP 0.5 µ g을 주사 하는 물고기에 비해 수준. 따라서, 충분히 높은 목표 유전자 발현을 위해 아직 충분히 작은 (≤7 µ L) 어떤 초과 조직 손상을 방지 하기 위해 또는 백신 누설 주입 볼륨을가지고, 우리 물고기 당 5 ~ 12 µ g를 사용 하 여 예비 심사 목적에 대 한 선택. 백신 immunogenicity, 충분 한 대상 유전자 발현 형광 현미경과 서쪽 오 점, 취재 원 유전자 발현을 검출 하는 데 필요한 높은 이외에 vivo 에서 올바른 확인을 목적으로 심사에 필요한 번역 대상 항 원입니다. 그러나, 낮은 플라스 미드 복용량 (0.5-1 µ g) 사용 하는 실험의 다른 유형에 대 한 유용할 수 있습니다.
결론적으로,이 프로토콜 DNA 플라스 미드와 성인 zebrafish의 예방 접종에 대 한 다양 한 세균 이나 바이러스 감염에 대 한 새로운 백신 후보자의 전 임상 시험에 사용할 수 있습니다. 백신 항 원의 식을 GFP 융해 단백질으로 성공적인 예방 접종 이벤트 및 항 원 식의 시각화 수 있습니다. 우리는 결핵에 대 한 새로운 백신 항 원 후보자의 전 임상 스크리닝이이 방법 적용. 이 위해, 우리 zebrafish 5 주 postvaccination 감염 하 고 정량20,24각 물고기에는 세균성 계산 결정 합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 실험 면역학 연구 그룹의 구성원에 게 감사 그리고 특히 하 Leena Mäkinen Hannaleena Piippo, 모든 작업에 대 한 그들은 개발 및 예방 접종 프로토콜 및 실제 실험에 그들의 도움을 최적화 프로토콜을 사용 하 여.
이 작품은 제인 자에 의해 지원 되었다 Aatos Erkon Säätiö (인과 Aatos Erkko 재단; M.R.에), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius 재단, M.R.), 탐 페 레 대학의 전문가 책임 영역의 경쟁 국가 연구 자금 병원 (M.R.)에, Tampereen Tuberkuloosisäätiö (템 퍼 결핵 재단, M.R., 흠, 그리고 M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (핀란드 문화 재단;의 HM), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (핀란드어 결핵 재단; HM)에 Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö 및 Laina Kivi 재단; M.N. 하)와 탐 페 레 도시 과학 재단 (M.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
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