Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離
Summary
ネイティブ グリーン ゲル電気泳動による可溶化されたチラコイドの複合体を分離するためのプロトコルをご紹介します。緑のゲルのバンドが後で時間相関単一光子計数 (ピコ) を特徴と、データ分析のための基本的な手順が提供されます。
Abstract
光合成の明反応はチラコイド膜の色素タンパク質複合体のシリーズによって遂行されます。長くて光合成環境条件の変化に適応するプロセスにより短い時間スケールの化学量論とこれらの複合体の組織は非常にダイナミックな (すなわち、非光化学消光、状態遷移と長期的な応答)。歴史的に、これらのプロセスで説明されている分光変更の面でクロロフィル蛍光と分光法による光合成パラメーターを監視するための重要な方法に残る。基になるタンパク質の複雑なダイナミクスを視覚化できる方法は限られています。ここでシンプルかつ高速高分解能分離とチラコイド錯体、ネイティブの緑のゲルの電気泳動の可視化法について述べる。このメソッドは、時間相関単一光子計数バンド緑のゲルの分離のクロロフィル蛍光特性の詳細な評価のために結合されています。
Introduction
光合成生物は常に彼らの生産性を最大化し、隣人1正常に競う環境条件の変化に自分の生理機能を調整する必要があります。これは周囲の光影と完全な日光の間 3 つの一桁によって変動することが条件として、光合成の明反応に責任がある機械の特に当てはまります。さらに、干ばつ、冷、熱ストレスなどの環境要因は炭素固定、光反応の製品の自然の電子のシンクであるため二酸化炭素の可用性を減らすことができます。植物は、必要があります、したがって、収穫し、必要に応じて余分な光エネルギーを消費する能力を維持しながら日射をできるだけ効率的に活用します。一方、光酸化損傷はまだすべて光の条件2,3、管理の失敗の下で日常的に発生、吸収励起エネルギーが正常に壊滅的な細胞の損傷と死につながることができます。光合成装置の一般的な環境条件の変化と過渡変動 (すなわち、長くて短いタイム スケールで)4の両方を調整することができるいくつかの適応メカニズムが存在します。長期的な応答 (LTR) と非光化学消光 (NPQ) が含まれます。状態遷移 (qT)、急速に誘導エネルギー焼入 (qE)、光阻害 (qI)5を含む少なくとも 3 つの他のコンポーネント現象を包含すると考え自体は NPQ です。
これらのプロセス最初の観察・分光現象面で大きく定義 [例えばNPQ を指しますドロップ率の増加によるものではない (クロロフィル蛍光の消光) 観察されたクロロフィル蛍光の光化学]6。「状態遷移」という用語は同様に PSI と PSII7から蛍光性の相対的な量変化を指します。これらの現象の列挙を可能にした分光学的手法をしながら [特に、パルス振幅変調 (PAM) 蛍光分光法] 観察し、で光合成プロセスを切り裂くのための不可欠な手段であり続けるとvivo、多大な生化学のこれらの分光観測を基になる機構を解明する必要です。状態遷移には、例えば、STN7 キナーゼとホスファターゼ TAP38/PPH1、それぞれ8,9,10によって LHCII 蛋白質のリン酸化/脱燐酸化のサイクルが含まれます。このサイクルは、PSII から PSI、それによって吸収が変更に LHCII スチレンダイマーの一部を移動して 2 つダメージを与える間 LHCII アンテナの物流を調整しますダメージを与える11,12の断面図。NPQ の qE コンポーネントは、ビオラキサンチン/ゼアキサンチン エポキシ化/デ-エポキシ化サイクルと PsbS 蛋白質の行動を通して熱に余分な励起エネルギーを急速に変換します。この過程で PsbS の正確な役割はまだ完全に理解した13。NPQ、光阻害の qI コンポーネントは一般的に、PSII の D1 タンパク質にダメージを与えるせいにしました。完全光合成能力の回復には、破損した PSII photocenters を修正する精巧な修復プロセスが必要です。PSII 修繕周期には、PSII 錯体、グラナのスタックの複合体の解体、破損した D1 タンパク質の交換、PSII の複合体の再構築とグラナ スタック14に戻る光化学複合体の動きからの移行が含まれます。PSII 症状や光阻害の正確な性質のまま15強い精査の主題です。
遷移状態のような現象を研究の難しさや、PSII 修理に起因しない複雑な生化学システムの仕組みを可視化する 1 つの簡単な方法があるという事実の一部。プロセスを理解する古典的な生化学的アプローチは、最初にそのコンポーネントを切り離すことで、単独で特徴付けられます。ネイティブ電気泳動は分離しより多くの分取方法 (すなわちショ糖勾配遠心法とクロマトグラフィー)16チラコイド膜から光化学系複合体を特徴付けるに 1980 年代の成功した努力から生まれた。優しくチラコイド膜からネイティブの複合体の可溶化開発洗剤システムはアレンと Staehelin17によって最も顕著に電気泳動分離法すぐに合わせられたとピーターと Thornber18上昇を与えるネイティブ グリーンにゲルの電気泳動を実行します。さまざまな実験のアーセナルでは、ネイティブのページでテクニックを表す 1 つだけが光合成の研究で広く使用されている方法を作ったそれ魅力的な特性の数。ネイティブのページは比較的高速かつシンプルで、同時に多数のチラコイド錯体の高リゾリューションの分離を提供しながら、少し特殊な装置を必要とします。これはネイティブ ページをチラコイドのダイナミクスを研究するためと、さまざまな洗剤とバッファーのシステムを発見し、新しいチラコイド錯体を特徴付けるのため汎用性の高いシステムと同様に、2 番目の次元の標準ページと組み合わせると便利なツールになります。
ネイティブの緑のジェルと抱えている特に経験の浅い手での信頼性の低い手法であるという評判だが簡単にいくつかのバンドが付いているファジィ、べたつくゲルから成る悪い結果を生成します。この問題は、一部、青ネイティブ ページ19の導入で解決されました。BN バッファー システムの coommassie 色素の使用は蛋白質の分離をより強固になります。したがって、BN ページを設定する相対的な初心者のための簡単かつより信頼性の高い技術は、しばしば、チラコイド錯体の高解像度版を提供することができます。これらの理由から、BN-PAGE – このフィールドのほとんどの仕事のための選択の方法となっています。BN-PAGE – が一般的にその主な欠点は、緑のゲルの電気泳動よりも実行に時間がかかる coommassie 染料染色も下流ながらかすかなクロロフィルを含むバンドの同定と干渉する分光特性が問題となります。
ネイティブのゲルに生化学的な情報提供し、分光学的手法からのデータと組み合わせると、2次元 SDS ページを大幅強化することができます。採用システムにかかわらず複合体を識別するネイティブのゲルを使用して中心の問題であること識別は、常に挑戦することができます (すなわち、蛋白質バンドで発見可能性があります常に comigrating 複合体またはコンポーネントを表すではなく単一生理学的本格的な複雑なより)。分光法によるキャラクタリゼーションと生物物理について緑のゲルのバンドの色素複合体のどのような種類が含まれている可能性を決定するため使用することができます。クロロフィル蛍光は、しばしば劇的に異なるスペクトルと異なる光合成色素蛋白複合体の特徴である、蛍光寿命のためにこの点で特に便利です。簡単な定常 77 K 蛍光スペクトルを歴史的にネイティブ ゲル複合体の身元を確認するのに役立つされている、現代時間相関単一フォトンカウンティング (ピコ) より多くの情報を提供できます。ピコだけでなく蛍光寿命に基づく複合体の特性がまた可能、複雑なスペクトル成分間のエネルギー移動の詳細な説明になります。特性のこの種は様々 なネイティブ ゲル系スプレッドの使用としてますます必要になっているとより良い認証するタンパク質複合体の同定ができ、新しいを提供する、新しい推定錯体を発見これらの複合体のしくみの生物物理については。
本稿で我々 はネイティブ チラコイド複合体の光反応のメカニズムを検討するための高品質の解像度を達成するためにネイティブ電気泳動とほとんど、あるいは全くの経験を有することができる方法を提供します。光合成。この基本的な方法は、結果を改善または他の種への適用性を拡張する実験者の裁量で拡張できます。我々 は、基本的な分析と技術によって提供されるデータのプレゼンテーションのためのいくつかの手順と同様に、ピコ、ネイティブの緑のゲルのバンドを施すプロセスをについて説明します。ピコによるネイティブ電気泳動のカップリングは、認証およびバンド内タンパク質複合体の生物物理学的特性を提供することによってこれらのゲル系のユーティリティを拡張します。ここで説明した緑色のジェル システムは、いくつかの変更とアレンと Staehelin17によって開発された、シュワルツらと同じに基づいています。20です。 このシステムは、多くの一つですが、役にこの方法は、特定の機能を備えています。だは十分に急速、チラコイドの単離、ゲルの電気泳動とピコ解析便利なことができます実行されるので、1 日でサンプル ストレージと劣化の潜在的な問題がなくなります。また、このメソッドは、まだ最適化の程度によっては、優れた良いからその範囲の結果を提供しながら、経験の浅いユーザーの手に強力なを見つけます。
調査の下で生物学だけでなく、使用する洗剤とバッファーの両方のシステムでネイティブ ゲル上で可視化複合体依存心に負担することが重要です。洗剤とバッファーの異なるシステムが優先的に複合体のさまざまな種類を分離し、与えられた光合成生物はすべては、与えられた状況下で提示されます、他の生物から別の複合体を持っています。ここで説明したシステムは、シュワルツらで説明されている PSI megacomplexes の研究に特に適しています。20しかしそれ PSII megacomplexes を学習者がスペクトルのより不安定の端にあたります。チラコイドのタンパク質のネイティブ電気泳動で使用される様々 な洗剤とバッファー システムの包括的な研究は、ヤルヴィらを確認することをお勧めします。21と Rantalaら22。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功したチラコイドの可溶化とネイティブのゲルを実行は、大幅な歪みのないゲルの複数の明確な表示緑バンドの解像度またはバンドのスミアになります。ゲルをオーバー ロード、高濃縮、不適切なサンプル pH、不溶材料、速すぎるまたは高すぎる温度でゲルを実行して不適切に注がれたゲルが不十分な解決チラコイド錯体に貢献するかもしれないすべての要因。ゲル自体の条件を最適化し…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金援助と支援は、ミシガン州立大学で化学の部門によって提供されました。
Materials
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamide | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C 40% solution |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 |
References
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).
- Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).
- Dietze, l. L., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).
- Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
- Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).
- Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).
- Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).
- Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).
- Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).
- Minagawa, J. State transitions–the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).
- Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. , (2018).
- Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).
- Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).
- Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).
- Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).
- Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
