Summary

Gen expressie analyse van endotheliale cellen blootgesteld als u wilt schuintrekken Stress met behulp van meerdere parallelle-plaat Flow Chambers

Published: October 21, 2018
doi:

Summary

Hier, wordt een workflow voor de cultuur en gen expressie analyse van endotheliale cellen onder vloeistof schuifspanning gepresenteerd. Inbegrepen is een fysieke schikking voor gelijktijdig huisvesting en bewaking van meerdere stroom kamers in een gecontroleerde omgeving en het gebruik van een exogene referentie RNA voor kwantitatieve PCR.

Abstract

We beschrijven een workflow voor de analyse van genexpressie uit endotheliale cellen onder voorbehoud van een gestage laminaire stroom met behulp van meerdere gecontroleerde parallel-plaat stroom kamers. Endotheliale cellen vormen de cellulaire binnenbekleding van bloedvaten en chronisch worden blootgesteld aan de wrijvingskracht van de bloedstroom schuifspanning genoemd. Onder fysiologische omstandigheden, endotheliale cellen functie in aanwezigheid van verschillende shear stress omstandigheden. Dus, de toepassing van shear stress voorwaarden in in vitro modellen kan meer inzicht geven in endotheel reacties- in vivo. De zaal van de parallel-plaat stroom eerder gepubliceerd door Lane et al. 9 is aangepast aan het studeren endothelial genregulatie in de aanwezigheid en de afwezigheid van gestage (niet-Pulsatiele) laminaire flow. Belangrijke aanpassingen in de set-up voor laminaire flow zoals hier gepresenteerd omvatten een grote en toegewijde omgeving aan huis gelijktijdige stroom circuits, de monitoring van de stroomsnelheid in real-time, en het opnemen van een exogene referentie RNA voor de normalisatie van kwantitatieve real-time PCR-gegevens. Om te beoordelen meerdere behandelingen/voorwaarden met de toepassing van shear stress, worden meerdere stroom circuits en pompen gebruikt gelijktijdig binnen de dezelfde verwarmd en bevochtigde incubator. Het debiet van elk circuit van de stroom wordt gemeten voortdurend in real time op de standaardisering van shear stress voorwaarden tijdens de experimenten. Omdat deze experimenten meerdere voorwaarden hebben, gebruiken we ook een exogene referentie-RNA dat spiked-in op het moment van RNA extractie voor de normalisatie van RNA extractie en eerste-strand cDNA synthese efficiëntie. Volgt minimaliseren de variabiliteit tussen de monsters. Deze strategie is werkzaam in onze pijplijn voor de analyse van gen expressie met schuifspanning experimenten met behulp van de zaal parallel-plaat stroom, maar delen van deze strategie, zoals de exogene verwijst naar RNA spike-in, kunnen gemakkelijk en kosteneffectief worden gebruikt voor andere toepassingen.

Introduction

Vasculaire endotheliale cellen vormen de cellulaire binnenbekleding van bloedvaten in de gesloten cardiovasculaire systeem hogere soorten. Zij vormen de interface tussen het bloed en de weefsels en wordt gekenmerkt door luminal en abluminal oppervlakken. Het endotheel is een divers, actieve en adaptieve systeem dat regelt de bloedstroom, nutriënten mensenhandel, immuniteit en de groei van nieuw bloed schepen1. In het lichaam bestaan endotheliale cellen normaliter in een omgeving waar ze worden blootgesteld aan de wrijvingskracht van verkeer, shear stress2. Shear stress is een belangrijke regulator van endothelial cel gene expression3en endotheliale cellen poging om de schuifspanning binnen een bepaald bereik2,4. Endotheliale cellen tonen angiogenic patronen in de afwezigheid van shear stress5 die perfusie van het weefsel kunt verbeteren. Regionale patronen van verstoorde stroom en veranderde shear stress worden geassocieerd met de expressie van genen van inflammatoire6 en de ontwikkeling van atherosclerose7,8. Modellen met shear stress zijn dus een belangrijk onderdeel van het endotheel genregulatie begrip.

Beschrijven we een methode voor het bestuderen van de genregulatie in vasculaire endotheliale cellen onder de schuifspanning. Dit systeem maakt gebruik van niet-Pulsatiele stroom en bootst vloeistof shear stress niveaus en gehalte aan zuurstof dat model voorwaarden voor arteriële endotheliale cellen. Dit protocol bevat details van methoden voor de gene knockdown met behulp van RNA-interferentie (RNAi), de set-up voor de toepassing van shear stress met parallel-plaat stroom apparatuur en methoden voor de piek van een exogene reference RNA vóór de analyse door reverse-transcriptase kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Deze pijpleiding wordt gebruikt voor het bestuderen van genregulatie in endotheliale cellen in de aanwezigheid en de afwezigheid van laminaire schuifspanning en omvat een aanpassing van het apparaat van de stroom van parallel-plaat beschreven door Lane et al. 9. deze bijzondere set-up was bedoeld om de gelijktijdige evaluatie van meerdere experimentele omstandigheden waarmee directe vergelijking van shear stress voorwaarden, alsmede de normalisatie van RNA analyse. Een grote verwarmde eenheid met gecontroleerde luchtvochtigheid wordt gebruikt om meerdere afzonderlijke stroom chambers en pompen gelijktijdig worden uitgevoerd met een spuitsnelheid gecontroleerd voor elke vergadering van de kamer stroom in real time. De toepassing van deze set-up wordt gebruikt voor gene knockdown met behulp van RNAi in de omgeving van laminaire flow/schuifspanning, maar aspecten van dit protocol kunnen worden toegepast op elke beoordeling van RNA expressie.

Gemeenschappelijke aanpak van de toepassing van shear stress voor endotheliale cellen omvatten microfluidic systemen10, een kegel-en-plate viscosimeter11, en een parallel-plaat flow kamer12. Microfluidic systemen van verschillende fabrikanten zijn nuttig bij het bestuderen van mechanobiology en mechanotransduction in meerdere cel en weefseltypes (HLA) en een verscheidenheid van biofysische stimuli geweest. Voor endotheliale cellen, zijn zij gebruikt om te studeren endotheliale cellen in isolatie, evenals de interactie van endotheliale cellen en de handel in immuun of tumor cellen10. Deze systemen zijn echter minder geschikt voor het herstel van grote aantallen cellen9. Zowel de kegel-en-plate viscosimeter en parallel-plaat stroom chambers toestaan dat het herstel van grote aantallen cellen in confluente monolayers12. Deze systemen kunnen allerlei schuintrekken krachten en patronen12genereren. De parallel-plaat flow kamer vergadering9 heeft het voordeel dat real-time beeldvorming door het glazen raam te evalueren van de cellulaire morfologie op elk tijdstip kan worden uitgevoerd. Bovendien kan het perfusaat onder steriele omstandigheden worden verzameld. Voor het systeem hier gepresenteerd, kan de stroom ook worden gevolgd in real time en in een multi-kamer set-up, dat het onderhoud van shear voorwaarden tussen kamers vergemakkelijkt.

Voor representatieve experimenten, menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), die een macrovascular endothelial celtype vertegenwoordigt, worden gebruikt, en de shear stress voorwaarden die we gebruiken (1 Pa) arteriële omstandigheden (0,1 – 0,7 Pa). Echter dit protocol kan worden gebruikt met andere endothelial celtypes, en de voorwaarden van de afschuifweerstand kunnen worden aangepast volgens de experimentele vraag. Bijvoorbeeld, de evaluatie van menselijke endotheliale cellen in omstandigheden die model veneuze circulatie zou vereisen lagere niveaus van shear stress (1-6 Pa) en studies die model microvasculaire verkeer hebben gebruikt shear stress niveaus van 0.4 – 1.2 Pa13 , 14. Bovendien schuifspanning zelfs tussen endotheliale cellen binnen de dezelfde bloedvat6kan variëren. In de huidige opzet, een enkele controlesysteem wordt gebruikt dat tegelijkertijd vier afzonderlijke stroom lussen kunt controleren. Voor labs moeten meer stroom lussen, is er ruimte in de speciale omgeving voor een extra systeem van toezicht.

RT-qPCR wordt gebruikt voor de absolute kwantificatie van genexpressie in de omgeving van shear stress. De relatieve uitdrukking van doelgenen wordt vaak gebruikt om RNA expressie van voorwaarden met elkaar vergelijken. Sommige soorten RNA kan bestaan in zeer lage hoeveelheden of afwezig, dus complicerende relatieve metingen. Bijvoorbeeld, kunnen lang noncoding RNAs in endotheliale cellen krachtige effecten op relatief lage moleculen per cel5uitoefenen. Bovendien kunnen verschillen in de efficiëntie van de primer leiden tot een onjuiste interpretatie met behulp van de delta-delta cyclus drempel (Ct) methode om de gegevens te analyseren. Om aan deze bezorgdheid, voeren wij absolute kwantificatie door het genereren van een standaard curve met behulp van een bekende hoeveelheid van plasmide DNA. Anderzijds complementaire DNA (cDNA)-synthese is een inefficiënt proces, en verschillen in cDNA efficiëntie kunnen goed zijn voor verschillen in RNA expressie tussen voorwaarden en monsters15. De toepassing van shear stress en/of transfectie reagentia kan beïnvloeden celproliferatie, apoptosis en levensvatbaarheid, of toevoegen van onderdelen die met isolatie en/of cDNA synthese van RNA interfereren kunnen. Om de mogelijkheid van bias van RNA isolatie en cDNA synthese te verklaren, gebruiken we een spike-in RNA besturingselement gesynthetiseerd in het lab, toegevoegd op het moment van RNA extractie en gemeten met elke cDNA synthese via RT-qPCR. Dit maakt niet alleen de aanpassing voor technische in RNA extractie en cDNA synthese verschillen, maar maakt het ook mogelijk de berekening van de absolute hoeveelheden per cel, wanneer het aantal cellen is bekend.

Dit systeem maakt gebruik van aanvullende stappen te handhaven gelijkenis of verantwoordelijk voor de technische verschillen tussen voorwaarden. Wij benadrukken bijzonder volgt vanwege de complexe aard van deze experimenten, waarbij meerdere fysieke set-ups en experimentele omstandigheden die tot experimentele variabiliteit leiden kunnen.

Protocol

1. bereiding van exogene referentie RNA Opmerking: Kies een exogene verwijzing RNA dat niet bestaat in de soort of het model van belang. Voor zoogdieren systemen, kan firefly luciferase RNA worden gebruikt. Linearisatie van exogene referentie RNA plasmide Bereiden van exogene referentie RNA ten minste 48 uur vóór de verwachte RNA extractie. Verkrijgen of vervaardiging van een cDNA-kloon van de gekozen exogene verwijzing RNA, zoals een firefly luciferase …

Representative Results

Succesvolle linearisatie van luciferase plasmide met behulp van restrictie-enzymen werd bevestigd door lopende verteerd producten op een agarose gel (Figuur 1). De grootte van het gelineariseerde product werd bevestigd met behulp van DNA ladders en vergelijking met Onbesneden plasmide. We hebben de parallel-plaat flow kamer set-up van Lane et al. aangepast 9 voor exp…

Discussion

Shear stress is een fysiologische toestand die de functie van het endotheel, gedeeltelijk moduleert door het beïnvloeden van de stationaire toestand gen expressie2,5. Modellen van genregulatie in verschillende shear stress omstandigheden zal bijdragen tot een beter begrip van endothelial functie. Deze pragmatische workflow omvat een circuit van de stroom met behulp van een kamer van de stroom van parallel-plaat aangepast van Lane et al. <sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door CIHR MOP 142307 P.A.M. H.S.J.M. is een ontvanger van een Canadese instituten van gezondheid onderzoek trainingsprogramma in regeneratieve geneeskunde Fellowship. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. en M.K.D. zijn de ontvangers van de Queen Elizabeth II afgestudeerde beurzen in de wetenschap en technologie.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA gibco 25300-062
10 mL Syringe BD 302995
10 mm2 Culture Dish Sarstedt 83.3902
30 mL Syringe BD 302832
4-Way Stopcocks Discofix D500
Aluminum foil
BEACH Darwin Chambers Company MN: HO85, SN: 4947549
Cell Scrapers
CO2 Meter BioSphenix, Ltd. MN: P120, SN: 0342
CO2 Sensor BioSphenix, Ltd. MN: C700, SN: 52852
Distilled water gibco 15230-170
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- gibco 14190-144
Endothelial Cell Growth Medium 2 Promo Cell C-22011
Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix Promo Cell C-39216
Fibronectin (pure) Sigma-Aldrich 11051407001
Filter (0.20 um) Sarstedt 83.1826.001
Flow Dampener and Cap U of T glass blowing shop
Flow Meter: 400 Series Console Transonic Scisense Inc. T402
Flow Meter: 400 Series Tubing Transonic Scisense Inc. TS410
Flow Reservoir and Cap U of T glass blowing shop
Flow Sensor Transonic Scisense Inc. ME4PXL
Isotemp 737F Oven Fisher Scientific FI-737F
J cloth J cloth
Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) Fisherfinest 12-544-4
Paper sterilization pouch Cardinal Health 92713
Pump (Masterflex L/S Economy Drive) Cole-Parmer 7554-90
Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) Cole-Parmer 7518-00
Rectangular 4 Well Dish Thermo Scientific 267061
Tweezers
Name Company Catalog Number Comments
Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-14
Name Company Catalog Number Comments
Luer
3/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-08 For #25 tubing
1/8" Male Luer Cole-Parmer 30800-24 For #16 tubing
1/8" Female Luer Cole-Parmer 30800-08 For #16 tubing
1/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-00 For #14 tubing
1/16" Female Luer Cole-Parmer 45508-00 For #14 tubing
Name Company Catalog Number Comments
Knockdown reagents
Oligofectamine Reagent Invitrogen 12252-011
Opti-MEM I Reduced Serum Medium gibco 31985-070
Name Company Catalog Number Comments
In vitro transcription
Generuler 1kb+ DNA ladder Thermo Scientific SM1331
MEGAclear Kit Ambion AM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
pSP-luc+ Promega E4471
Supercoiled DNA Ladder New England BioLabs Inc. N0472S
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500
UltraPure Ethidium Bromide Invitrogen 15585011
XhoI Restriction Enzyme New England BioLabs Inc. R0146S
Name Company Catalog Number Comments
RNA extraction
Beta-mercaptoethanol Sigma M3148-100mL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104

References

  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  3. Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  4. Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
  5. Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
  6. Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  7. Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  9. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
  10. Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
  11. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
  12. Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
  13. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  14. DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
  15. Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
  16. Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
  17. Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
  18. Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
  19. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
  20. Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).

Play Video

Cite This Article
Man, H. J., Sukumar, A. N., Ku, K. H., Dubinsky, M. K., Subramaniam, N., Marsden, P. A. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. J. Vis. Exp. (140), e58478, doi:10.3791/58478 (2018).

View Video