הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa
Summary
כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.
Abstract
מחקרים שנעשו לאחרונה תאים כל תיקון-קלאמפ של נוירונים הסובסטנציה gelatinosa (SG) סיפקו גוף גדול של מידע אודות המנגנונים בעמוד השדרה שידור חושית, תקנה nociceptive ופיתוח כרוני כאב או גירוד. מימושים של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות יחד עם לימודי מורפולוגי המבוסס על השירות של חוט השדרה חריפה פרוסות השתפרו עוד יותר את ההבנה שלנו של מאפייני עצביים, ההרכב של המעגלים המקומיות ב ס ג. כאן, אנו מציגים מדריך מפורט ומעשי עבור הכנת חוט השדרה פרוסות הצג נציג כל-תא ולהקליט תוצאות מורפולוגי. פרוטוקול זה מאפשר שימור עצביים אידיאלי, ניתן לחקות תנאים ויוו במידה מסוימת. לסיכום, היכולת לקבל הכנה של במבחנה של חוט השדרה פרוסות מאפשרת יציבה זרם, מתח-להדק הקלטות, ובכך יכול להקל על נתונים היסטוריים חקירות המאפיינים קרום פנימי, המעגלים המקומיות, מבנה עצביים באמצעות גישות מגוונות.
Introduction
Gelatinosa הסובסטנציה (SG, הנדן השנייה של ‘ קרן ‘ בעמוד השדרה הגבי) היא מרכז חשוב עוררין ממסר עבור משדר וויסות מידע חושי. הוא מורכב interneurons סינאפסות, אשר מקבלים תשומות הסיבים מביא העיקרי, interneurons מקומיים, מעכבות מערכת יורד1אנדוגני. במהלך העשורים האחרונים, הפיתוח של חוט השדרה חריפה פרוסה הכנה, כניסתו של תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה אפשרו מחקרים שונים המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות ו מורפולוגי פנימי של ס ג נוירונים2, 3 , 4 , כמו גם מחקרים של המעגלים המקומיות ב ס ג5,6. בנוסף, באמצעות במבחנה חוט השדרה פרוסה ההכנה, חוקרים יכולים לפרש את השינויים ב-7,excitabilities עצביים8, הפונקציה של יון ערוצי9,10, ו פעילות סינפטית11,12 בתנאים פתולוגיים שונים. מחקרים אלה יש העמיקה הבנתנו התפקיד כי ס ג נוירונים לשחק בפיתוח ותחזוקה של נוירופתי בגירוד וכאב כרוני.
במהותה, היא תנאי מוקדם מפתח כדי להשיג פריט חזותי ברור של סומא עצביים, אידיאלי תאים כל תיקון חוט השדרה חריפה בפרוסות כדי להבטיח את איכות מעולה של פרוסות אז ניתן להשיג את הנוירונים patchable ובריאה. עם זאת, הכנת חוט השדרה פרוסות כרוך במספר שלבים, כגון ביצוע laminectomy הגחוני של הסרת קרום pia-בחופשיות, אשר עשוי להיות מכשולים בהשגת פרוסות בריא. למרות שלא קל להכין פרוסות חוט השדרה, ביצוע הקלטות במבחנה על חוט השדרה פרוסות יש מספר יתרונות. לעומת ההכנות התרבות תאים, חוט השדרה פרוסות יכול חלקית לשמר קשרים סינפטיים הגלום שנמצאים במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, תיקון שלם-תא-הקלטה באמצעות חוט השדרה פרוסות קלאמפ יכול להיות בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון תיקון כפול קלאמפ13,14,15,מחקרים מורפולוגי16 תא בודד RT-PCR 17. לכן, טכניקה זו מספקת מידע נוסף על אפיון את הבדלים אנטומיים, גנטיים בתוך אזור מסוים, מאפשר חקירה של ההרכב של המעגלים המקומיות.
כאן, אנו מספקים תיאור בסיסי ומפורט של השיטה שלנו עבור הכנת חריפה השדרה פרוסות ורכישת תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות מ ג נוירונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרטים זה פרוטוקול השלבים להכנת פרוסות בחוט השדרה, אשר השתמשנו בהצלחה בעת ביצוע ניסויים תאים כל תיקון-קלאמפ ב ס ג נוירונים18,19,20,21. על-ידי יישום שיטה זו, דיווחנו לאחרונה minocycline, דור שני של טטרציקלין, יכול לשפר במידה ניכרת הס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מס 81560198, 31660289).
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
