Kvantitativ Autoradiografisk metode til bestemmelse af de regionale rater for cerebral protein syntese in vivo
Summary
Protein syntese er en kritisk biologisk proces for celler. I hjernen, er det nødvendigt for adaptive ændringer. Måling af satser for proteinsyntese i den intakte hjerne kræver omhyggelige metodologiske overvejelser. Her præsenterer vi L-[1-14C]-leucin kvantitativ autoradiographic metode til bestemmelse af regionale satser for cerebral proteinsyntese in vivo.
Abstract
Protein syntese er nødvendig for udvikling og vedligeholdelse af neuronal funktion og er involveret i adaptive ændringer i nervesystemet. Desuden menes det, at dysregulering af proteinsyntese i nervesystemet kan være en kerne fænotype i nogle udviklingsmæssige lidelser. Nøjagtig måling af raterne af cerebral proteinsyntese i dyremodeller er vigtig for at forstå disse lidelser. Den metode, vi har udviklet, var designet til at blive anvendt til studiet af vågen, opfører dyr. Det er en kvantitativ autoradiographic metode, så det kan give satser i alle regioner af hjernen samtidig. Metoden er baseret på brugen af en Tracer aminosyre, L-[1-14C]-leucin, og en kinetisk model af opførsel af L-leucin i hjernen. Vi valgte L-[1-14C]-leucin som Tracer, fordi det ikke fører til fremmede mærkede metaboliske produkter. Det er enten indarbejdet i protein eller hurtigt metaboliseres til at give 14co2 , som er fortyndet i en stor pulje af ikke-mærket Co2 i hjernen. Metoden og modellen giver også mulighed for bidrag af ikke-mærket leucin afledt af vævs proteolyse til vævs forløberen for proteinsyntese. Metoden har den rumlige opløsning til at bestemme proteinsyntese satser i celle og neuropil lag, samt hypothalamus og kranielle nerve kerner. For at opnå pålidelige og reproducerbare kvantitative data er det vigtigt at overholde proceduremæssige detaljer. Her præsenterer vi de detaljerede procedurer for den kvantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucin metode til bestemmelse af regionale satser for proteinsyntese in vivo.
Introduction
Protein syntese er en vigtig biologisk proces, der kræves for langsigtet adaptiv ændring i nervesystemet1. Inhibe ring proteinsyntese blokerer langsigtet hukommelse opbevaring i både hvirvelløse dyr og hvirveldyr2. Protein syntese er afgørende for vedligeholdelse af de sene faser af nogle former for langsigtede potensering (LTP) og langvarig depression (LTD)3, neuronal overlevelse under udvikling4, og for generel vedligeholdelse af neuronen og dens synaptisk tilslutninger5. Måling af satser for hjernen proteinsyntese kan være et vigtigt redskab til at studere adaptive ændringer samt neuroudviklingsmæssige lidelser og lidelser relateret til indlæring og hukommelse.
Vi har udviklet en metode til at kvantificere satserne for cerebral proteinsyntese in vivo i et vågen dyr, der tilbyder iboende fordele i forhold til andre teknikker, der estimerer satser i ex vivo eller in vitro præparater af hjernevæv6. Først og fremmest er anvendeligheden til målinger i den intakte hjerne i et vågen dyr. Dette er en vigtig overvejelse, fordi det giver mulighed for målinger med synaptisk struktur og funktion på plads og uden bekymringer om post mortem effekter. Desuden opnår den kvantitative autoradiografiske tilgang, som vi anvender, en høj grad af rumlig lokalisering. Mens energien af 14C er sådan, at vi ikke kan lokalisere Tracer på subcellulære eller cellulære niveau, kan vi måle satser i cellelag og små hjerneområder som hypothalamus kerner, med ca. en 25 μm opløsning7.
En af udfordringerne ved in vivo-målinger med aktive er at sikre, at radioaktivt mærkede måles i produktet af en reaktion af interesse i stedet for ureageret mærket forløber eller andre fremmede mærkede metaboliske produkter6. Vi valgte L-[1-14C]-leucin som Tracer aminosyre, fordi det enten er indarbejdet i protein eller hurtigt metaboliseres til 14Co2, som er fortyndet i den store pulje af ikke-mærket Co2 i hjernen som følge af den høje hastighed af energimetabolisme8. Desuden findes alle 14c, der ikke er indarbejdet i protein, primært som fri [14c]-leucin, som over 60 minutters forsøgsperiode er næsten helt ryddet fra vævet6. Proteiner er derefter fastgjort til væv med formalin og efterfølgende skylles med vand for at fjerne enhver fri [14C]-leucin før Autoradiografi.
En anden vigtig overvejelse er spørgsmålet om fortynding af den specifikke aktivitet af prækursor aminosyre puljen ved ikke-mærkede aminosyrer afledt af vævs proteolyse. Vi har vist, at i voksne rotte og mus, omkring 40% af forløberen leucin pool for proteinsyntese i hjernen kommer fra aminosyrer afledt af protein opdeling6. Dette skal indgå i beregningen af de regionale satser for cerebral Proteinsyntese (rCPS) og skal bekræftes i undersøgelser, hvor dette forhold kan ændre sig. Metodens teoretiske grundlag og antagelser er blevet præsenteret i detaljer andetsteds6. I dette dokument fokuserer vi på de proceduremæssige spørgsmål i forbindelse med anvendelsen af denne metode.
Denne metode har været anvendt til bestemmelse af RCPS i jordegern9, får10, rhesus aber11, rotter12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, en musemodel af tuberøs sklerose Complex22, en musemodel af skrøbelige x-syndrom23,24,25,26, skrøbelige x premutation mus27, og en musemodel af fenylketonuri28. I dette manuskript præsenterer vi procedurerne for måling af Rcp’er med den in vivo Auto adiografiske L-[1-14C]-leucin-metode. Vi præsenterer rCPS i hjernen regioner af en vågen kontrol mus. Vi viser også, at in vivo administration af anisomycin, en inhibitor af oversættelse, afskaffer proteinsyntesen i hjernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi fremlægger en kvantitativ metode til bestemmelse af de regionale satser for cerebral Proteinsyntese (rCPS) in vivo i forsøgsdyr. Denne metode har betydelige fordele i forhold til eksisterende metoder: 1. Målingerne foretages i vågen opfører dyret, så de afspejler igangværende processer i den fungerende hjerne. 2. Målingerne foretages ved hjælp af kvantitativ Autoradiografi, der giver mulighed for at bestemme Rcp’er i alle regioner og subregioner af hjernen samtidigt. 3. metodens kinetiske model tager hensyn t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Zengyan XIa for genotypebestemmelse af musene, Tom Burlin til behandling af aminosyrer og film, og Mei Qin for at udføre nogle af de rCPS eksperimenter. Denne forskning blev støttet af Intramural Research program af NIMH, ZIA MH00889. RMS blev også støttet af en autisme taler postdoc Fellowship 8679 og en FRAXA postdoc stipendium.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
