Kvantitativ autoradiografisk metod för bestämning av regionala frekvenser av cerebral protein syntes in vivo
Summary
Protein syntes är en kritisk biologisk process för celler. I hjärnan, det krävs för adaptiva förändringar. Mätning av frekvenser av proteinsyntes i intakt hjärna kräver noggranna metodologiska överväganden. Här presenterar vi L-[1-14C]-leucine kvantitativ autoradiografiska metod för bestämning av regionala satser av cerebral proteinsyntes in vivo.
Abstract
Protein syntes krävs för utveckling och underhåll av neuronala funktion och är involverad i adaptiva förändringar i nervsystemet. Dessutom, det är tänkt att dysreglering av proteinsyntes i nervsystemet kan vara en kärn fenotyp i vissa utvecklingsstörningar. Noggrann mätning av graden av cerebral proteinsyntes i djurmodeller är viktigt för att förstå dessa sjukdomar. Den metod som vi har utvecklat var avsedd att tillämpas på studiet av vaken, beter sig djur. Det är en kvantitativ autoradiografiska metod, så det kan ge priser i alla regioner i hjärnan samtidigt. Metoden är baserad på användning av en Tracer aminosyra, L-[1-14C]-leucin, och en kinetisk modell av beteendet hos L-leucin i hjärnan. Vi valde L-[1-14C]-leucin som Tracer eftersom det inte leder till främmande märkta metaboliska produkter. Det är antingen införlivas i protein eller snabbt metaboliseras för att ge 14Co2 som späds ut i en stor pool av omärkta Co2 i hjärnan. Metoden och modellen möjliggör också bidrag av omärkta leucin härrör från vävnad proteolys till vävnaden föregångare pool för proteinsyntes. Metoden har den rumsliga upplösningen för att bestämma proteinsyntes hastigheter i cell-och neuropil-skikt, samt hypotalamus och kranialnervkärnor. För att få tillförlitliga och reproducerbara kvantitativa data är det viktigt att följa procedur detaljerna. Här presenterar vi de detaljerade förfarandena för den kvantitativa autoradiografiska L-[1-14C]-leucine metod för bestämning av regionala frekvenser av proteinsyntes in vivo.
Introduction
Protein syntes är en viktig biologisk process som krävs för långsiktig adaptiv förändring i nervsystemet1. Hämmande proteinsyntes blockerar långsiktig minneslagring i både ryggradslösa djur och ryggradsdjur2. Protein syntes är viktigt för underhåll av de sena faserna av vissa former av långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD)3, neuronala överlevnad under utveckling4, och för allmänt underhåll av neuron och dess synaptiska anslutningar5. Mätning av graden av hjärnans proteinsyntes kan vara ett viktigt verktyg för att studera adaptiva förändringar samt neurologiska utvecklingsstörningar och störningar i samband med inlärning och minne.
Vi har utvecklat en metod för att kvantifiera graden av cerebral proteinsyntes in vivo i ett vaket djur som erbjuder inneboende fördelar jämfört med andra tekniker som uppskattar priser i ex vivo eller in vitro-preparat av hjärnvävnad6. Främst är tillämpligheten till mätningar i intakt hjärna i ett vaket djur. Detta är en viktig faktor eftersom det tillåter mätningar med synaptisk struktur och funktion på plats och utan oro för post mortem-effekter. Dessutom uppnår den kvantitativa autoradiografiska metoden som vi anställer en hög grad av rumslig lokalisering. Energin i 14C är sådan att vi inte kan lokalisera spårämne på subcellulär eller cellulär nivå, vi kan mäta priser i cellskikt och små hjärnregioner såsom hypotalamus kärnor, med cirka 25 μm upplösning7.
En utmaning av in vivo mätningar med radiotracers är att se till att radiomärkas mätt är i produkten av reaktionen av intresserar i stället för unreagerade märkt föregångare eller annan ovidkommande märkta metaboliska produkter6. Vi valde L-[1-14C]-leucin som Tracer aminosyra eftersom det är antingen införlivas i protein eller snabbt metaboliseras till 14Co2, som späds ut i den stora poolen av omärkta Co2 i hjärnan till följd av den höga energimetabolism8. Dessutom finns alla 14c som inte ingår i protein i första hand som fria [14c]-leucin, som under den 60 min experimentella perioden, är nästan helt rensas från vävnaden6. Proteiner är sedan fast till vävnad med formalin och därefter sköljas med noga bort någon fri [14C]-leucin före Autoradiography.
En annan viktig faktor är frågan om utspädning av den specifika aktiviteten av föregångaren aminosyran pool av omärkta aminosyror som härrör från vävnad proteolysis. Vi har visat att hos vuxna råtta och mus, om 40% av föregångaren leucin pool för proteinsyntes i hjärnan kommer från aminosyror som härrör från proteinnedbrytning6. Detta måste ingå i beräkningen av regionala frekvenser av cerebral proteinsyntes (RCP) och måste bekräftas i studier där detta förhållande kan förändras. Den teoretiska grunden och antagandena av metoden har presenterats i detalj någon annanstans6. I detta dokument fokuserar vi på procedurfrågor vid tillämpningen av denna metodik.
Denna metod har använts för bestämning av RCP i mark ekorrar9, får10, rhesusapor11, råttor12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, en musmodell av tuberös skleros Complex22, en musmodell av bräcklig x syndrom23,24,25,26, bräcklig x premutation möss27, och en musmodell av fenylketonuri28. I detta manuskript presenterar vi förfarandena för mätning av RCP med den in vivo autoradiografiska L-[1-14C]-leucine metoden. Vi presenterar RCP i hjärnregioner av en vaken kontroll mus. Vi visar också att i vivo administrering av anisomycin, en hämmare av översättning, avskaffar proteinsyntesen i hjärnan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar en kvantitativ metod för bestämning av regionala frekvenser av cerebral proteinsyntes (RCP) in vivo i försöksdjur. Denna metod har avsevärda fördelar jämfört med befintliga metoder: 1. mätningar görs i den vakna beter djur, så de återspeglar pågående processer i den fungerande hjärnan. 2. mätningar görs med hjälp av kvantitativ autoradiografi som ger möjlighet att bestämma RCP i alla regioner och del regioner i hjärnan samtidigt. 3. den kinetiska modellen av metoden tar hänsyn till m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna Zengyan Xia för genotypning av möss, Tom Burlin för bearbetning av aminosyror och filmer, och Mei Qin för att utföra några av de RCP experiment. Denna forskning stöddes av intramural forsknings program av NIMH, ZIA MH00889. RMS stöddes också av en autism talar postdoktor Fellowship 8679 och en FRAXA postdoktor gemenskap.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
