Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie
Summary
ICP0 ondergaat nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenis is niet bekend. Hier beschrijven we het gebruik van de confocal microscoop als een hulpmiddel om te kwantificeren ICP0 beweging in HSV-1 infectie, die de basis legt voor het kwantitatief ICP0 translocatie in toekomstige mechanistische studies te analyseren.
Abstract
Geïnfecteerde cel eiwitten 0 (ICP0) van herpes simplexvirus (HSV-1) 1 is een onmiddellijke vroege eiwit met een RING-type E3 ubiquitin ligase. Het is verantwoordelijk voor de afbraak van de remmen van host beperkende factoren en de activering van latere virale gen. ICP0 bevat een reeks canonieke nucleaire localisatie (NLS). Het komt de kern onmiddellijk na DOVO synthese en voert haar anti-host defense functies voornamelijk in de kern. Echter verderop in infectie, is ICP0 aangetroffen uitsluitend in het cytoplasma, het voorkomen van een nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Vermoedelijk kan ICP0 translocatie ICP0 te moduleren van haar functies aanroept volgens haar subcellular locaties op verschillende infectie fasen. Om het af te bakenen de biologische functie en regelgevende mechanisme van ICP0 nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie, bewerkt we een immunefluorescentie microscopie methode voor het controleren van de ICP0 handel tijdens HSV-1 infectie. Dit protocol omvat immunefluorescentie kleuring, confocal microscoop beeldapparatuur en nucleaire vs. cytoplasmatische distributie analyse. Het doel van dit protocol is te passen de steady-state confocal opnamen in een tijdsverloop in een kwantitatieve documentatie ICP0 verkeer gedurende de lytische infectie. Wij stellen voor dat deze methode kan worden gegeneraliseerd om nucleaire vs. cytoplasmatische lokalisatie van andere virale of cellulaire eiwitten kwantitatief te analyseren zonder tussenkomst van levende imaging technologie.
Introduction
Herpes simplexvirus (HSV-1) 1 zorgt ervoor dat een breed scala van milde tot ernstige herpetic ziekten zoals herpes labialis, genitale herpes, stromale keratitis en encefalitis. Eenmaal besmet, wordt het virus een levenslang latente infectie in ganglia neuronen. Soms kan het virus worden gereactiveerd door diverse redenen zoals koorts, stress en immuun onderdrukking1, leiden tot recidiverende herpes infectie. Geïnfecteerde cel eiwitten 0 (ICP0) is een belangrijke virale regelgever cruciaal voor zowel lytische en latente infectie van de HSV-1. Het transactivates stroomafwaarts virus genen via het tegengaan van de host intrinsieke/aangeboren antivirale verdedigingen2,3. ICP0 heeft een E3 ubiquitin ligase activiteit, die gericht is op verschillende factoren van de cel voor proteasoom-afhankelijke degradatie3. Het interageert ook met verschillende trajecten van de cel om hun activiteiten te reguleren en vervolgens ter compensatie van de host antivirale beperkingen3. ICP0 is bekend om te zoeken op verschillende subcellular compartimenten naarmate de infectie3,4,5 vordert. Het eiwit heeft een lysine/arginine-rijke nucleaire localisatie signaal (NLS) gelegen op residuen 500 naar 5066. Bij DOVO synthese op vroege infectie van de HSV-1, is ICP0 direct geïmporteerd in de kern. Het wordt eerst gedetecteerd bij een dynamiek van nucleaire structuur genoemd nucleaire domein 10 (ND10)7. De E3 ubiquitin ligase activiteit van ICP0 activeert de afbraak van ND10 organisator eiwitten, promyelocytic leukemie (PML) eiwitten en gespikkelde eiwit 100 kDa (Sp100)8,9,10. Na het verlies van eiwitten van de organisator, ND10 nucleaire organen zijn verspreid en ICP0 wordt verspreid om te vullen de hele kern4,11.
Interessant, na het begin van virale DNA replicatie verdwijnt ICP0 uit de kern. Het is uitsluitend gevonden in het cytoplasma, suggereert de aanwezigheid van een nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie laat in HSV-1 infectie4,12. De eis van de DNA-replicatie impliceert de mogelijke betrokkenheid van een late virale expressie gebrachte eiwitten bij het vergemakkelijken van de cytoplasmatische translocatie van HSV-1 ICP04,12. Blijkbaar ICP0 handel tussen verschillende compartimenten tijdens infectie machtigt ICP0 te differentiëren van de interacties aan verschillende cellulaire routes in een ruimtelijke-temporele mode, en daarom coördinaat zijn meerdere functies te fine tunen het evenwicht tussen de lytische en latente HSV-1 infectie13. Om beter te begrijpen ICP0 multifunctionaliteit en de coördinatie van de functionele domeinen ICP0 gedurende de lytische infectie, ontleed we zorgvuldig de moleculaire basis van de dynamische ICP0 translocatie12. Om uit te voeren het mechanistisch onderzoek eerder gemelde12, hebben we een immunefluorescentie kleuringstechniek om te visualiseren subcellular localisatie van de ICP0 op verschillende infectie status onder confocal microscoop toegepast. We hebben ook een kwantitatieve protocol om te analyseren de nucleaire vs. cytoplasmatische verdeling van ICP0 met behulp van de confocal software ontwikkeld. De bevolking van HSV-1 besmette cellen was tabelvorm tijdens de fasen van de infectie en de trends van de ICP0 beweging werden geanalyseerd, onder verschillende biochemische behandelingen12. Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol dat documenten ICP0 translocatie in HSV-1 infectie. Wij stellen voor dat deze methode kan worden vastgesteld als een algemene methode om te studeren van de nucleaire vs. cytoplasmatische translocatie voor andere virale of cellulaire eiwitten, die als alternatief dienen kan voor levende imaging wanneer de levende imaging techniek niet van toepassing is vanwege is problemen zoals het labelen van de methode, signaal intensiteit of eiwit overvloed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is gebruikt voor het bestuderen van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van HSV-1 ICP0. ICP0 ondergaat subcellular handel tijdens HSV-1 infectie (Figuur 1). Waarschijnlijk, ICP0 communiceert met verschillende trajecten van de cel voor het uitvoeren van verschillende functies op verschillende locaties. Hierdoor ICP0 te fine-tunen van haar veelvoudige functies in de krachtmeting met menselijke gastheer13. Echter, hoe ICP0 coördineert de veelvou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de financiële steun van een toegekende aan Haidong Gu NIH-subsidie (RO1AI118992). Wij danken de microscopie, Imaging & Cytometry middelen (MICR) Core faciliteit aan de Wayne State University voor technische ondersteuning.
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. Herpes simplex viruses. Fields’ Virology. , 1823-1897 (2013).
- Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
- Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
- Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
- Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
- Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
- Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
- Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
- Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
- Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
- Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
- Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?. Future Virology. 13 (6), (2018).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
- Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
