体外流动下单核细胞亚群的同时研究
Summary
在这里, 我们提出了一个综合协议, 测量单核细胞亚群贩运在流在体外使用特定的表面标记和共聚焦荧光显微镜。该协议可用于探索顺序招募步骤, 以及使用其他特定的表面标记来描述其他白细胞亚型。
Abstract
在组织损伤、肿瘤发育和自身免疫性疾病的过程中, 从血液中招募单核细胞到靶向外周组织对炎症过程至关重要。这是通过捕获过程从自由流动到腔表面的激活内皮细胞, 其次是他们的粘附和内皮迁移 (转移) 到底层受影响的组织。然而, 支持优先和与上下文相关的单核细胞亚群招募的机制仍未得到充分理解。因此, 我们开发了一种方法, 允许在流量下同时对不同单核细胞亚群的招募进行可视化和测量。这种基于延时共聚焦成像的方法允许在粘附体和迁移单核细胞之间进行明确的区分。在这里, 我们描述了如何使用这种方法可以同时研究招募的亲血管生成和非血管生成单核细胞在体外。此外, 这种方法还可以推广到研究最多三个单核细胞种群的不同招募步骤。
Introduction
单核细胞是先天免疫的吞噬成分, 对于对抗病原体、清理受损组织、血管生成以及包括癌症在内的许多疾病的病理生理学至关重要..单核细胞是由异质亚群组成的骨髓细胞, 在血液中循环, 但可以通过特定的分子机制被招募到外周组织的炎症部位。与一般白细胞一样, 单核细胞的招募级联涉及不同的步骤, 包括捕获、滚动、爬行、逮捕、内皮迁移 (转移) 和通过血管壁 (基底膜和壁画) 的迁移单元格)4。这些步骤主要涉及炎症引起的内皮腔表面的分子, 如选择、糖蛋白配体、趋化因子、细胞间和结合粘附分子, 以及它们对白细胞的受体, 如选择性配体和整合。通过内皮细胞连接 (脱细胞后) 或通过内皮细胞体 (跨细胞) 的贩运途径可被白细胞用于跨越内皮屏障5。虽然历史上有记录表明单核细胞通过跨细胞途径迁移, 但由于单核细胞不再被视为同质细胞群, 它们迁移途径中的潜在差异已被提出。现在越来越清楚的是, 单核细胞多样性可以通过它们的每一个差异和共性来定义, 就它们独特的外渗级联 3,6。因此, 为了明确区分单核细胞亚群, 在招募过程中, 将这些不同亚群的行为形象化和表型是至关重要的。
将人、猪、大鼠和小鼠的单核细胞细分为表型亚群, 具有一定的归因功能和特定的迁移行为7,8,9。例如, 在人类中, 单核细胞可以根据其表面表达的 cd14 (细菌脂多糖的核心受体) 和 cd16 (fc-γ受体 iii) 分为三个子集。人类单核细胞亚群包括经典 cd14+cd16–、中间 cd14+cd16+和非经典 cd14 暗淡 cd16+细胞6,9。经典 cd14+cd16–单核细胞主要具有炎症性, 而 cd16 + 单核细胞池被共同发现为 tie2表达和血管生成功能10。持续, 内皮细胞刺激与炎症细胞因子, 如人类肿瘤坏死因子 (tnf) α或白细胞介素 (il-1)beta (常规炎症) 足以引发经典 cd14+cd16 的完全招募–单核细胞然而, 血管内皮生长因子 (vegf) a 和 tnfα (血管生成因子引起的炎症) 同时作用, 是引发 cd16 + 单核细胞血管生成池 3的迁移.从历史上看, 传统的跨井系统在静态条件下, 平行板流动室和μ-滑动流室已被用来定量分析在体外一次招募一个白细胞群 11 ,12,13。虽然这些方案已经得到验证, 一个更强大的方法, 允许同时分析多个单核细胞亚群将被认为更有见地。这种方法必须考虑到多个相互作用和每个群体的不同频率, 并提供机械地理解定义每个单核细胞的招募级联的相似性和特殊性子集。
本文提出了一种基于流动过程中单核细胞招募延时成像的方法, 该方法可以利用共聚焦显微镜同时研究不同单核细胞亚群的迁移级联。该方法结合了某些关键特征, 模仿内皮细胞炎症, 以及在毛细血管后静脉循环单核细胞的血流动力学, 白细胞在体内招募的主要位置。该方法使用人脐静脉内皮细胞 (huvec), 这是通过与人脐带分离的既定协议产生的。这种临床资源的优点是很容易作为生物副产品获得, 同时也提供了一个合理的内皮细胞产量, 可以从脐静脉分离。我们还使用荧光染料和免疫荧光来区分不同的细胞成分, 并使用共聚焦显微镜明确定义单核细胞定位 (腔内与烧黑细胞) 随着时间的推移。本文所介绍的协议是为了同时测量单核细胞亚群的迁移水平而制定的。此外, 应当指出, 这种方法可以通过使用不同的生物标志物和标签, 扩大到研究其他白细胞亚群和招募过程。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们报告了一个方法详细介绍了单核细胞亚群如何通过发炎的内皮单层迁移的研究。讨论的方法采用共聚焦显微镜代替相对比显微镜, 也用于研究流3、11、19 下单核细胞的招募。使用共聚焦显微镜进行延时成像的一个主要优点是能够明确区分单核细胞的迁移和强粘附。虽然基于相对比显微镜的方法也很稳健, 但它需要专…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢保罗·布拉德菲尔德博士的手稿阅读和反馈。a. s. 得到了朱尔斯·索恩爵士慈善海外信托委员会的财政支持。
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
