多鼠脑的同时 Cryosectioning
Summary
在这里, 我们提出一个协议, 冻结和切片的大脑组织从多个动物作为一个玩意替代处理单一的大脑。这减少了免疫组化过程中的染色变异性, 减少了时间 cryosectioning 和成像。
Abstract
组织学和免疫组化是常规的分析方法, 以可视化显微解剖和本地化蛋白质在生物组织。在神经科学, 以及其他科学领域, 这些技术被使用。免疫组化可以做在幻灯片上的组织或自由浮动部分。准备幻灯片安装的示例是一个时间密集型的过程。以下技术的协议, 称为 Megabrain, 减少了 cryosection 和安装大脑组织的时间高达 90%, 通过结合多个大脑到一个单一的冰冻块。此外, 这种技术减少了染色回合之间的变异, 在一个大的组织化学研究。在下游免疫组化分析中, 利用啮齿动物脑组织对现有技术进行了优化;然而, 它可以应用到不同的科学领域, 使用 cryosectioning。
Introduction
在这里, 我们提出了一种新方法的协议, 我们称之为 Megabrain, 发展为 cryosection 多鼠大脑同时为下游免疫组化程序。Megabrain 允许生产含有多种动物组织的单张幻灯片。这项技术已被优化, 以切割冠状部分从9成年大鼠半球, 或5成人全脑, 同时。因此, 该技术最适用于大型免疫组化研究或其他分析, 对从一大群动物的幻灯片安装的脑组织进行。
免疫组化涉及使用特定的抗体针对感兴趣的蛋白质, 以了解和表征其表达和细胞变化的特定组织1,2,3。免疫组化的应用在神经科学研究中普遍存在, 在其他科学学科中, 帮助对大脑的细胞和分子的理解4。涉及许多动物和脑部的大规模研究可以是资源和时间密集型的。因此, Megabrain 的发展有多方面的理由: 减少花 cryosectioning、安装和染色组织的时间, 同时使用较少的试剂。此外, 在同一回合中简化过程和染色多个大脑的能力有助于缓解染色批次之间的一些变异性, 这是免疫组化3的局限性。此外, 切片 Megabrain 是一个节省时间的替代品切片单个冰冻啮齿动物的大脑, 并允许快速比较的组织之间的动物, 甚至治疗组的显微技术。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这一过程中应考虑到 Megabrain 及其周围环境的温度必须不断监测, 以防止组织的解冻和再冷冻。大脑只能从-20 °c 冷冻库中除去, 每次被接触和留在恒温器, 随着温度的升高, 组织解冻和 refreezes, 导致果冻像质地和异常的组织完整性10。因此, 最好同时切断 Megabrain。
组织固定和抗冻是本议定书的关键部分, 以尽量减少冰晶形成, 减少外部微生物生长, 停止酶反应…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH 特派团支助基金支持本手稿中报告的研究。作者想感谢丹尼尔. 格里菲斯拍摄了数字中使用的图像。
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
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