Summary
여기 선물이 엽록체의 정화에 대 한 검증 및 테스트 프로토콜 가져오기 단백질 복합물 (복잡 한 TIC TOC) 탭-태그를 사용 하 여. 1 단계 선호도 격리 프로토콜 잠재적으로 어떤 단백질에 적용 될 수 있습니다 그리고 질량 분석에 의해 새로운 상호 파트너를 식별 하는 데.
Abstract
엽록체 속에는 plastid 핵 인코딩 단백질의 수천의 가져오기를 필요합니다. 이 단백질의 가져오기 외부 (TOC)와 내부 (TIC) 엽록체 막에서 translocon에 따라 달라 집니다. 목차 및 TIC 단지 multimeric 이며 아마 아직 알 수 없는 구성 요소를 포함. 필드에 주요 목표 중 하나 목차 및 TIC 부품의 전체 인벤토리를 구축 하는 것입니다. 목차-TIC 단지의 절연 및 새로운 구성 요소 식별을 위한 TOC159 되었습니다 preprotein 수용 체 N 말기 탭 TOC159에서 결과 협동 선호도 정화 (꼭지) 태그를 추가 하 여 수정. 탭-태그 두 순차 선호도 정화 단계 위한 것 이다 (그러므로 "탠덤 선호도"). N 맨끝 IgG-바인딩 도메인 calmodulin 바인딩 펩 티 드 (CBP)에 의해 포도 상 구 균 단백질 (ProtA) 뒤에서 파생 된 이러한 연구에 사용 된 탭 태그에 의하여 이루어져 있다. 이러한 두 가지 선호도 태그 사이 담배 바이러스 (TEV) 효소 분열 엣지 사이트 포함 되었습니다. 따라서, TEV 프로 테아 제 바인딩 IgG 구슬에 후 TOC159 포함 된 단지의 부드러운 차입에 대 한 사용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 두 번째 Calmodulin 선호도 정화 단계 생략 되었다. 정화 프로토콜 준비 및 총 세포 막의 가용 화와 함께 시작합니다. 세제-치료 후 solubilized 막 단백질 탭 TOC159 포함 된 단지의 immunoisolation에 대 한 IgG 구슬 알을 품는. 바인딩 및 광범위 한 세척, 탭-TOC159 포함 하 단지 죽 습 고 미 균 IgG-바인딩 도메인 제거에 의하여 TEV 프로 테아 제를 사용 하 여 IgG 구슬에서 발표. 서 부는 절연 blotting TOC159 포함 된 단지 사용할 수 있습니다 알려진 또는 의심 목차와 콩 단백질의 존재를 확인 하. 더 중요 한 것은, TOC159 포함 된 단지 사용 되었습니다 성공적으로 목차와 TIC 단지의 새로운 구성 요소를 식별 하는 질량 분석에 의해. 선물이 잠재적으로 프로토콜 어떤 막-바인딩 단백질의 효율적인 절연을 복잡 한 질량 분석에 의해 아직 알 수 없는 구성 요소 식별에 사용할 수 있습니다.
Introduction
식물은 광합성 및 photoautotrophic 성장1엽록체에 따라 달라 집니다. 엽록체 단백질의 대부분은 핵에서는 cytosol에서 합성 인코딩되고 봉투 막2TIC 및 목차 단지 통해 엽록체로 가져올. Toc75 단백질 실시 채널 및 2 개의 수용 체 GTPases Toc33 Toc1593,,45복잡 한 TOC의 핵심에 의하여 이루어져 있다. TOC159의 엽록체 속에 대 한 필수적 이며 광합성 관련 단백질6의 거 대 한 축적을 중재 한다. TIC20 단백질 실시 채널 뿐만 아니라 TIC110 및 TIC407,8TIC 복합물에 의하여 이루어져 있다. 최근, 1MD 단백질 전 내부 봉투 막에 복잡 한 격리 되었고 이전 미확인된 구성 요소9, 중 하나는 TIC56를 포함. 우리가 최근에 공동 격리 탭 TOC159 선호도 정화 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 1 MDa의 TIC56. 데이터 표시 및 1 MDa 복잡 한10"정식" 목차/TIC 단지 사이의 구조 중복. 이전 탭 메서드를 사용 하 여 목차와 TIC 단지의 새로운 상호 작용 파트너10,11여기 설명한 KOC1와 같은 알 수 없는 구성 요소 확인 또한 되었다.
따라서, 탭 태그 정화 단백질 복합물의 고립 및 후속 대량 spectrometric 분석12상호 작용 파트너의 식별에 대 한 효율적인 방법입니다. 탭 태그 이루어져 있다 두는 담배 calmodulin 바인딩 펩 티 드 (CBP)에서 구분 하는 IgG 바인딩 반복 에칭 바이러스 (TEV) 효소 분열 사이트. IgG 선호도 정화 단계 구성 된 원래 방법 TEV 분열 및 후속 calmodulin 친화성 크로마토그래피 허용 크고 높은 순수 단백질 단지13,14 의 네이티브 정화 . 우리 절차를 단순화 하 고는 포함 하는 TOC159 단백질 복합물 수 또한 정화 차입15TEV 분열 뒤 IgG 선호도 정화 단계만을 사용 하 여 효율적으로 시연 했다. 우리의 경험에서는, calmodulin 선호도 단계 생략 높은 수익률을 귀착되 고 그러므로 낮은 풍부한 단백질에 대 한 적절 한 있을 수 있습니다.
간단히 말해서, 우리는 안정적인 유전자 변형 A. thaliana 설계 탭-TOC159 ppi2 (toc159 코 돌연변이)에 표현 하는 라인 배경 및 목차-TIC 복합물의 정화에 대 한 신뢰할 수 있는 원본으로 설립. 목차-TIC 복합 절연에 대 한 프로토콜 세제 무료 버퍼에서 공장 설비 재료의 균질으로 시작합니다. 원심, 후에 상쾌한 삭제 됩니다. 펠 릿 총 막 분수를 포함 하는 세제를 포함 하는 버퍼를 사용 하 여 solubilized 이다. 울트라-원심 분리 단계 후 상쾌한 solubilized 목차 TIC 복합물을 포함 하는 친 화력 정화에 대 한 IgG-수 지에 적용 됩니다. 여러 후 세척 단계, 차입은 실시 IgG 바인딩 도메인의 및 부드럽게 선택적으로 하류 다니엘을 TEV protease 포함 된 버퍼를 사용 하 여 기본 TOC159 포함 된 단지를 출시. TEV eluate 부 럽 또는 TOC15910,,1115의 상호 파트너를 식별 하는 질량 분석에 의해 직접 분석할 수 있습니다. 메서드 또한 TOC15915의 포스트 번역 상 수정 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 미래에, 기본 TOC159 포함 된 단지 구조 연구 cryoelectron 현미경 검사 법을 사용 하 여 사용할 수 있습니다.
Protocol
1입니다. 애기 식물의 준비
- Skoog (MS)와 村 重 중간 포함 비타민 1% 자당의 절반 강도 1 리터를 준비 하 고 수산화 칼륨 (KOH)와 5.7에 pH를 조정. 120 ° c.에 phytoagar 및 20 분 압력솥의 0.8%를 추가
- 페 트리 접시 당 MS 매체의 75 mL를 붓고 (직경 14.5 c m, 높이 3 c m) 1 시간에 대 한 응고를 허용.
- 1.5 mL microfuge 관에 애기 thaliana 씨앗의 30 mg을 추가 그리고 표면 소독 0.05% (v/v)를 포함 하는 70% (v/v) 에탄올과 Triton X-100 5 분, 10 분에 대 한 (v/v) 에탄올 에탄올을 제거 뒤에 100%.
- 건조 살 균 필터 종이에 씨앗을 전송 합니다. (각 유전자 형 필요 적어도 8-10 접시) MS 판에 균등 하 게 소독된 씨앗을 뿌려와 각 플레이트 외과 테이프와 인감.
- 씨앗 발 아 동기화를 어둠 속에서 이틀 동안 4 ° C에서 번호판을 품 어. 다음 빛 주기와 성장 챔버에 전송: 120 µmol m−2의 − 1 , 8h와 22-20 ° c.에 어둠의 16 h
2. 준비 HsIgG Agarose 구슬의
- 100 ml의 1 m HCl m CNBr 활성화 agarose 구슬 (4 g)를 중단 하십시오 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
- 소 결된 유리 필터에 agarose 구슬 전송, 100 m m HCl의 100 mL와 진공에서 세척 하 고 2-3 회 반복.
참고: 쿨 워시 솔루션 4 ° c - Agarose 구슬 찬 100 m m HCl의 1 ml에서 및 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 resuspend. 100 m m HCl 3 mL와 함께 소 결된 유리 필터를 세척 하 고 같은 튜브에 액체를 전송.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전 시키십시오 그리고 제거는 피 펫과 상쾌한.
참고: 튜브를 가만히 따르다 하지 마십시오. - 커플링 버퍼 (표 1); 50 mL에 구슬 resuspend 짧게, 믹스와 다음 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전
- 동결 건조 된 호모 사피엔스 IgG (Hs-IgG)의 50 밀리 그램 커플링 버퍼의 10 mL에 녹, 부드럽게, agarose 구슬 믹스 및 4 ° c.에 하룻밤 회전 통에서 품 어
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전 시키십시오 그리고 제거는 피 펫과 상쾌한.
- IgG agarose 구슬 커플링 버퍼 및 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g 에서 스핀의 50 mL로 씻으십시오
- 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g 에서 블로킹 버퍼 (표 1)와 스핀의 50 mL와 IgG agarose 구슬 resuspend 한 번 반복 합니다.
- 블로킹 버퍼의 50 mL에 IgG agarose 구슬 resuspend, RT에서 2 시간 및 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g 에서 스핀에 대 한 혼합물을 회전
- 제거는 상쾌한 고 NaCl 커플링 버퍼 (표 1)의 200 mL에 IgG agarose 구슬 resuspend.
- 모든 나머지 상호 CNBr 그룹을 차단 하려면 100 mL의 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.8와 IgG agarose 구슬 세척. 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.8, 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전으로 세척 하 고 제거 하는 상쾌한. 마지막으로, IgG agarose 구슬 초순 물 200 mL와 함께 씻는 다.
- 워시 초순 물 200 mL와 200 mL PBS 버퍼 (표 1)의 IgG agarose 구슬.
- 20 ml PBS 버퍼 0.01% 할머니3 (나트륨 아 지 드)와 함께 IgG agarose 구슬 resuspend 및 4 ° c.에 저장
3. 격리와 막 분수의 가용 화
- 모래와 차가운 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 액체 질소에 3 주 오래 된 A. thaliana 묘 10 g을 갈아.
- 차가운 땅 조직의 10 g 버퍼 (표 1) 연 삭의 20 mL를 추가 하 고 잘, 얼음에 녹여.
- 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 빠른 여과 물자의 2 개의 층을 통해 homogenate를 필터링 합니다. 여과 하기 전에 버퍼를 연 삭으로 빠른 여과 소재를 담근 다.
- 4 ° C 및 이전에서 상쾌한 냉된 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 1500 × g 에서 10 분 원심 분리기는 filtrate 같은 한 번 더 고는 상쾌한 수집을 반복 합니다. "총 분수"의 200 µ L의 샘플을 유지 하 고 나중에 분석-80 ° C에서 저장
- 차가운 38.50 mL ultracentrifuge 관에는 상쾌한 전송 및 냉 연 삭 버퍼와 최대 35 mL 최고. ultracentrifuge에서 4 ° C에서 100000 × g 에서 1 시간에 대 한 원심 분리기.
- 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송. "녹는 분수"와 나중에 분석-80 ° C에서 저장소의 200 µ L의 샘플을 유지 합니다.
- 재 연 삭 버퍼에 유리 테 플 론 균질 화기를 사용 하 여 녹색 펠 릿을 일시 중단 합니다. ultracentrifuge에서 4 ° C에서 100000 × g 에서 1 h centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
- 18.75 ml 유리 테 플 론 균질 화기를 사용 하 여 버퍼를 연 삭 하는 x 1의 녹색 펠 릿을 resuspend 하 고 버퍼를 연 삭 하는 x 1의 9.375 mL를 추가 합니다.
- 주고 37.5 mL 4 ° c.에 "회전 통"에 30 분 동안 품 어 9.375 mL 4 x solubilisation 솔루션 (표 1) (TX-100 세제 포함)의 추가
- ultracentrifuge에서 4 ° C에서 100000 × g 에서 1 시간에 대 한 원심 분리기. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송. 200 µ L 샘플 상쾌한 (미래 "부하 분수")와 나중에 분석-80 ° C에서 저장소의 유지 합니다.
- 버퍼를 연 삭의 37.5 mL에 펠 릿을 resuspend. 불용 성 부분과 저장소-80 ° C에서의 샘플을 유지
4입니다. Immunoprecipitation
- 포장된 IgG agarose 수 지 버퍼 A에에서 (표 1)와 4 ° c.에서 5 분 동안 100 × g 에서 스핀의 100 µ L equilibrate
- 제거는 상쾌한 고 버퍼 A 4 ° c.의 100 µ L에서 IgG agarose 수 지 resuspend
- 씻어 IgG agarose 수 지 solubilized 막의 37.5 mL 전송과 4 ° c.에 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 회전 통에 밤새 품 어
- 앙금 IgG agarose 4 ° C에서 5 분 동안 100 × g 에서 수 지 하 고는 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다. 통해 "흐름"의 200 µ L의 샘플을 유지 하 고 나중에 분석-80 ° C에 저장 합니다.
- 버퍼 A의 37.5 ml에서 IgG agarose 수 지를 세척 하 고 회전 통에 10 분 동안 품 어.
- 토사 4 ° C에서 5 분 동안 100 × g 에서 IgG agarose 수 지는 피 펫과 상쾌한 제거 하 고 "세척 1"의 200 µ L 샘플 버퍼 A 15 mL 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에서 100 × g, 4 ° C, 5 분 유지 연 삭의 5 mL을 추가 하 고,-80 ° C에서 저장 나중 분석에 대 한.
- 반복 단계 3 번 버퍼 A. 세척 5 mL
- 억제제 (NaF, Protease 억제제와 PMSF) 없이 마지막 두 세척 단계 수행
참고: 억제제가이 단계에서 필요 이상 고 비용을 줄이기 위해 생략. 마지막 세척 단계 "최종 세척 (W6)"와 나중에 분석-80 ° C에서 저장소의 200 µ L의 샘플을 유지 합니다. - 35 µ m 필터 500 µ L 회전 열에 IgG agarose 수 지를 전송 하 고 구슬 TEV 차입 버퍼 (표 1)의 300 µ L로 두 번 (AcTEV를 포함 하지 않는) 평형에 대 한 씻어. 스핀 열을 닫습니다.
- AcTEV의 50 단위 (10 µ L)를 포함 하는 TEV 차입 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 수 지에 추가 하기 전에 튜브에 믹스를 준비 합니다.
- 16 ° C에서 thermomixer에 구슬 회전 열을 품 어, 2 헤 대 한 350 rpm 반전 열 부드럽게 여러 번 매일 30 분.
- 스핀 열을 열고, 새로운 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 eluate 수집 하 4 ° C에서 5 분 동안 100 × g 에서 스핀 장소.
- 건조 한 (예를 들어) 원심 증발 기에 eluted 샘플 (~ 25 µ L)의 10% (v/v) 및 질량 분석 또는 다른 추가 분석에 대 한 사용.
- Aliquot 나머지 eluate (~ 275 µ L)에서 분할 11 1.5 mL 원심 분리기 튜브 (25 µ L 각), 원심 증발 기에서 건조 하 고-80 ° c.에 저장 하기
- SDS 페이지 뒤 immunoblotting 표준 절차로는 있다 내내 유지 샘플을 분석 합니다. 샘플 준비, 촉진 50 µ g의 총 (T)에 대 한 부하 (L), (피트)을 통해 세척 1 (W1)와 클로 프롬/메탄올 추출16워시 6 (W6)의 200 µ L.
- SDS 페이지 로딩 버퍼 (표 1) 침전 된 샘플 x 2의 10 µ L eluted 말린된 샘플의 25 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 열 블록에서 95 ° C에서 10 분 동안 끓인 다.
- 총 (T), 로드 (L), (피트)을 통해 흐름, 워시 1 (W1), 분석 immunoblotting 안티-TOC159 항 체를 사용 하 여 격리 절차의 효율성을 결정 하 여 6 (W6) 및 차입 (E)를 씻어.
Representative Results
우리는 여기 유전자 변형 A. thaliana 에서 복잡 한 탭 태그 엽록체 봉투 단백질의 정화에 대 한 프로토콜을 설명 식물. 그림 1A같이 식물을 표현 하는 35S:NTAP-TOC159 구문 식물 35S:NTAP 구문 표현 컨트롤으로 사용 했다이 복잡 한 격리 하는 데 사용 했다. 그림 1 B 는 질량 분석 상호 작용 단백질의 식별 수 있도록 다음 탭 TOC159 단백질 복합물의 정화의 세부 단계를 보여 줍니다. Immunoblot 분석 (그림 2, 오른쪽) 격리 탭-TOC159 TOC75와 TOC33의 목차 복잡 한 상호 작용을 확인 합니다. 엽록체 외부 막 키 KOC1 TOC159 또한 탭 TOC159 복잡 한 (그림 2B, 오른쪽)와 함께 공동 절연 phosphorylate 알려져. TIC110의 존재 고립 된 탭 TOC159 복잡 한 TIC 복합 구성 요소 포함을 보여준다. FBN1A 항 체 단백질 가져오기 무관 plastoglobule 단백질에 대 한 발생 오염 결핍을 나타내는 탭 TOC159 복잡 한을 인식 하지 않았다. 부정적인 통제에서 immunoprecipitated NTAP 단백질 목차-콩 단백질 (그림 2, 왼쪽)의 공동 격리 하지 않았다 고 탭 TOC159 정화의 특이성을 확인 합니다.
그림 1 . 구문 및 선호도 정화 절차의 계획. (A).는 35S:NTAP-TOC159 NTAP TOC159 인코딩 구조는 안정적으로 애기 thaliana표현. 네거티브 제어 식물 인코딩 탭-태그 혼자 35S:NTAP 구문 표현. (B). 막 분리 및 가용 화, IgG agarose 면역-정화, 세척, TEV protease 절단, 차입의 단계 현명한 선호도 정화 프로토콜 구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . TOC159 단백질의 탠덤 친 화력 정화. N-말기 탭 태그 TOC159 NTAP-TOC15에서 순화 했다:ppi2 애기 식물과 탭 탭: WT 식물에서 순화 하는 단백질은 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 총 단백질 추출 물 (T), solubilized 막 단백질 = 부하 분수 (L), (피트)을 통해 먼저 하 고 마지막 세척 분수 (W1 및 W6)와 TEV eluate의 10%는 서쪽 blotting에 의해 분석 되었다. 멤브레인 TOC159에 대 한 항 체와 함께 조사 했다 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), 및 FBN1A (AT4G04020). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
버퍼의 테이블 | ||
커플링 버퍼 | NaHCO3 조정 pH 8.5 0.1 m M 나2CO3 pH 조정 |
100 m m |
버퍼를 차단 | 트리 스-HCl HCl로 pH 8로 조정 합니다. |
100 m m |
PBS 버퍼 | 나2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl HCl로 pH 7.3으로 조정 됩니다. |
4.3 m m 1.4 m m 137 2.7 |
NaCl 버퍼 커플링 | 커플링 버퍼 NaCl |
1 M |
버퍼를 연 삭 X 2 | Tris HCl, HCl로 pH 7.5 NaCl NaF PMSF 공장 프로 테아 제 억제 물 칵테일 |
100 m m 200 mM 5 mM 1mm 0.20% |
Solubilisation 솔루션 X 4 | 글리세롤 트리톤 X100 |
40% 3% |
버퍼 A | 버퍼를 연 삭 X 2 버퍼를 갈기 X 1 Solubilisation 솔루션 X 4 |
100 ml 50 ml 25 ml 25% |
TEV 차입 버퍼 | HCl로 pH 8 Tris HCl EDTA, HCl로 pH 8 NaCl 글리세롤 트리톤 X100 DTT |
50 mM 0.5 m m 100 m m 10% 0.75% 1mm |
SDS 페이지 로드 x 2 버퍼 | HCl와 Tris HCl pH 6.8 SDS 글리세롤 Bromophenol 블루 DTT |
0.1 M 4% 20% 0.20% 0.2 M |
표 1입니다. 버퍼 조리법입니다.
Discussion
우리는 한 번 탭 태그 정화 애기 목차 TIC 복합물의 정화에 대 한 구체적이 고 효율적인 방법을 시연 했다. 탭-태그 두 연속적인 정화 단계 (IgG-calmodulin 친 화력 정화 TEV 프로 테아 제-분열 후 다음) 허용, 하지만 우리는 많은 경우 TEV protease 분열 뒤 선호도 첫걸음 충분할 것 이다 믿습니다. 우리의 목표, TOC159, 풍부한 낮은 이며 두 번째 calmodulin 선호도 단계 포함 지나치게 우리의 현재 프로토콜에서 제외에 대 한 주요 이유는 단백질 수확량 감소. 그 자체로 TEV 차입 유지 됩니다 비-특히 IgG 수 지에 집착 하는 단백질을 오염 하는 동안 관련 된 상호 작용 협동자와 함께 탭 태그 대상 해제 됩니다 매우 특정 하 고 부드러운 정화 단계 이다. 따라서, IgG 선호도 단계와 함께, TEV 차입 결과 우리의 고 아마도 많은 다른 사람들의 목적을 위해 충분히 효율적인 정화.
해야 합니다 주의 탭 태그 구문 완전 한 기능 비보이다. 탭에 태그를 추가 하는 것은 단백질 활동, 안정성 또는 지역화에 잠재적으로 해로운 효과 있을 수 있었다. 3 개의 도메인, 신랄 한 N 맨끝 도메인, 중앙 GTP 바인딩 도메인 및 그 외부 엽록체 막2TOC159 앵커 C 터미널 막 도메인 TOC159에 의하여 이루어져 있다. 막 삽입 잠재적인 간섭을 유발 하지 않도록, 우리는 TOC159의 N-말단에 탭 태그 융합. N-말단에 퓨전 오히려 규칙 보다 예외입니다. 많은 단백질 N-터미널 대상 정보를 포함 하 고 C-말단에 의해 태그 따라서 한다. 우리는 TOC159 탭 TOC159와 기능 vivo에서 ppi2 돌연변이 (TOC159 부족 한 알 비 노 돌연변이)의 보완성은 안심. 녹색의 구조, 야생 타입 형 탭 TOC159 기능15가 표시 됩니다.
정화 프로토콜은 TOC159, KOC1 및 TIC5610,11을 포함의 새로운 상호 작용 파트너를 식별 하기 위해 사용 되었다. 합계에서는, 약 30 단백질 새로운 상호 파트너 격리 되며 가까운 미래에 특징을 제안 하는 복잡 한와 관련 되었다. 우리는 매우 복잡 한 정화에 대 한 탭 태그 권장, 우리 여전히 여기 하나 추가 버전 존재 하 고 일부 응용 프로그램에 매우 유용 수 있습니다 지적 고 싶습니다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
작품 (31003A_156998 및 31003A_176191) 스위스 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 그리고 뉴 샤 텔 대학에 의해 지원 되었다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
EDTA | Carl Roth | 8043 | |
Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
Filter paper | Whatman | 10311804 | |
Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
References
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