גידול חיידקים Magnetotactic של סוג Magnetospirillum: זנים MSR-1, השגריר-1 ו- MS-1
Summary
אנו מציגים הליך לגידול זנים שונים של Magnetospirillum שני סוגים שונים של מדיה צמיחה. Magnetospirillum gryphiswaldense זן MSR-1 גדל נוזלי והן O2 ריכוז הדרגתי מדיה מוצק למחצה ואילו זן מ magneticum השגריר-1 וזן magnetotacticum מ MS-1 גדלים במדיום נוזלי.
Abstract
Magnetotactic חיידקים הם גראם שליליים, תאי, בעיקר הימית אאוקריוטים בכל מקום בבתי גידול מים מתוקים ומי ים. הם מאופיינים על ידי היכולת שלהם biomineralize magnetosomes, אשר מגנטי בגודל ננומטר גבישי מגנטיט (Fe3או4) או greigite (Fe3S4) מוקף קרום bilayer השומנים, בהישג שלהם הציטופלסמה. עבור רוב החיידקים magnetotactic הידוע, magnetosomes הם התאספו כבול בתוך הציטופלסמה, ובכך היוועצות עם מומנט דיפול מגנטי קבוע על התאים ולגרום להם ליישר פסיבי עם שדות מגנטיים חיצוניים. בגלל תכונות אלה ספציפיים, חיידקים magnetotactic יש פוטנציאל גדול עבור יישומים מסחריים וטיפול רפואי. עם זאת, רוב המינים הינם microaerophilic וכוללים O2 ריכוז דרישות ספציפיות, הפיכתם קשה יותר לגדול באופן שגרתי יותר חיידקים רבים אחרים כגון Escherichia coli. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורט לגידול שלושה זני חיידקים magnetotactic, שייכות הסוג Magnetospirillumלמדה נרחב ביותר. שיטות אלה מאפשרות שליטה מדויקת של2 O הריכוז נעשה זמין של חיידקים, על מנת להבטיח כי הם גדלים בדרך כלל, לסנתז magnetosomes. גידול חיידקים magnetotactic ללימודי באמצעות הליכים אלה אינו מחייב את experimentalist להיות מומחה במיקרוביולוגיה. שיטות כלליות שהוצגו במאמר זה עשוי לשמש גם כדי לבודד את התרבות חיידקים magnetotactic אחרים, אם כי סביר להניח כי ההרכב הכימי של מדיה צמיחה תצטרך להיות שונה.
Introduction
Magnetotactic חיידקים (MTB) מייצגים מגוון רחב של אאוקריוטים גראם שליליים בכל מקום גידול ימיים מים מתוקים ומי ים1. חיידקים אלה חולקים את היכולת לייצר מגנטי קריסטלים העשויים מגנטיט (Fe3או4) או greigite (Fe3S4), אשר ברוב המקרים לצרפן שרשראות בתוך התאים. זה מוטיב מבנית מסוימת היא בשל נוכחותם של מספר חלבונים ספציפיים מתנהג כאחד בציטופלסמה של החיידקים ועל הרקמות שמקיפות השומנים כל קריסטל2. כל קריסטל בודדים, שלה שלפוחית ממברנה שמסביב נקרא magnetosome, הוא החל בגודל של 30 עד 50 ננומטר מינים Magnetospirillum 3. בשל הסידור שרשרת של magnetosomes, חיידקים אלו בעלי רגע דיפול מגנטי קבוע שגורם להם ליישר פסיבי עם שדה מגנטי חיצוני. לכן, חיידקים אלו באופן פעיל לשחות לאורך קווי שדה מגנטי, מתנהג כמו מיקרו-מצפנים מרסיסים ככל הנראה כדי יותר לאתר ביעילות את התנאים הכי נוחים (למשל., ריכוז2 O) לצמיחה.
תכונה מעניינת של MTB היא יכולתם לווסת את הכימיה והן את קריסטלוגרפיה של גבישים magnetosome שלהם. רוב זני לייצר גבישים טוהר גבוהה יחסית של מגנטיט או greigite, למרות כמה biomineralize שני מינרלים4. בכל המקרים, החיידקים מסוגלים לשלוט במדויק הגודל והצורה של גבישים מחשבים בודדת מגנטי שלהם. זה מסביר מדוע כמות גדולה של מחקר שנערך לפתח הבנה טובה יותר של כיצד MTB לבצע תהליך זה ביומינרליזציה. הבנת תהליך זה עלול לאפשר את החוקרים חייט-לעשות nanocrystals מגנטי עבור יישומים רבים מסחרי ורפואי.
מכשול משמעותי מחקר מקיף על שחרור מהיר למוט אוכף כבר הקושי של גידול אותם במעבדה. רוב המינים, כולל הזנים להשתמש בעבודה זו, הן obligately microaerophilic כאשר גדל עם O2 כמו מקבל אלקטרון מסוף. זה מסביר מדוע חיידקים אלו מצויים לרוב באיזור המעבר בין תנאי oxic ואנאוקסיים (הממשק oxic-אנאוקסיים, OAI). זה מראה בבירור שיש MTB מדויק O2 ריכוז דרישות אשר מן הסתם צריך להילקח בחשבון כאשר להמציא צמיחה מדיה עבור אורגניזמים אלה. יתר על כן, קיים מגוון רחב של MTB מרמז כי זנים שונים צריך סוגים שונים של מעברי צבע כימיים וחומרים מזינים כדי להשיג גדילה אופטימלית.
בעבודה זו, אנו מתארים את שיטות הגוברת של MTB נרחב ביותר למד: Magnetospirillum magneticum (זן השגריר-1), מ magnetotacticum (MS-1) ו- gryphiswaldense מ’ (MSR-1). המינים הללו phylogenetically שייך למחלקה Alphaproteobacteria ב שלקרוא פרוטאובקטריה , לוליינית ב מורפולוגיה הינם בעלי שוטון קוטבי בקצה אחד של התא. אנו מספקים את הפרוטוקולים לגידול זן MSR-1 נוזל והן O2 ריכוז הדרגתי מוצק למחצה מדיה, מבוסס על מתכונים שפורסמו בעבר בינוני5,6. אנו מציגים גם פרוטוקול מפורט לגידול זנים השגריר-1 ו- MS-1 במגנטי Spirillum צמיחה בינוני (MGSM) שונה7.
Protocol
Representative Results
Discussion
O2 ריכוז דרישות ספציפיות של MTB להפוך אותם לא טריוויאלי לגדול במעבדה. צעד. מפתח של הפרוטוקול עבור המדיום הנוזלי היא הסרת הראשונית של כל O2 של המדיום כדי לשלוט הריכוז הסופי על-ידי הוספת אמצעי מובהק של O2, ממש לפני חיסון. הוכח כי MSR-1 גדל בתנאים כמעט במלואה אירובי, עם זאת, המגנטיות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ריצ’רד ב’ פרנקל לעזרתו עם שחרור מהיר למוט אוכף תרבויות, אדם עמ’ היצ’קוק, ז’ו Xiaohui על תמיכתם תוך הגדרת התרבויות MTB באוניברסיטת מקמסטר, וריד מרשה הכשרה וגישה אל המתקן מיקרוסקופ אלקטרונים (אוניברסיטת מקמסטר, הפקולטה למדעי הבריאות). עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC), בנו הקרן הלאומית למדע.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A ‘capillary racetrack’ method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
