Очистка и пробирного активность In Vitro для ppGpp (p) синтетаза с Clostridium difficile
Summary
Здесь мы описываем метод для очистки гистидин меткой pyrophosphokinase ферментов и используя тонкий слой хроматографии радиоизотопами субстратов и продуктов для анализа для ферментативной активности в пробирке. Assay активность фермента широко применима к любой киназы, циклазы нуклеотидов или реакции фосфора передача, механизм которого включает нуклеотидов трифосфата гидролиза.
Abstract
Киназы и pyrophosphokinase ферменты передать фосфат гамма или бета гамма пирофосфат остаток от нуклеотида трифосфата прекурсоров субстратов для создания фосфорилированных продуктов. Использование γ –32– P пометкой прекурсоры NTP позволяет одновременный мониторинг использования и продукта формирования субстрата, рентгенография. Хроматографии (ТСХ) тонким слоем на пластины целлюлозы позволяет быстрое разделение и чувствительных количественной оценки субстрата и продукта. Мы представляем метод для использования тонкослойной хроматографии для анализа активности pyrophosphokinase очищенный синтетаза ppGpp (p). Этот метод использовался ранее для характеризовать деятельность циклических нуклеотидов и динуклеотид синтетаз и широко подходит для характеризующие активность фермента, который гидролизует Бонд трифосфата нуклеотидов или передает терминал фосфат с донором фосфатной к другой молекуле.
Introduction
Киназы и pyrophosphokinase (или diphospho киназы) ферментов передать фосфатов из нуклеотидов трифосфата (NTP) прекурсоров молекулы субстрата. Подложки могут включать другие нуклеотиды, аминокислоты или белки, углеводы и липиды1. Bioinformatic анализы иногда можно предсказать фермента родственных субстрата или подложек, основанный на схожести с характеризуется ферментов, но по-прежнему необходима экспериментальная проверка. Аналогичным образом сходство фермент для его substrate(s) и скорость, с которой она катализирует реакцию люминофор передача и последствия сопутствующих факторов, ингибиторы, или другие фермента эффекторы должны быть определены экспериментально. Чтобы избежать истощение АТФ прекурсора других АТФ потребителями ферменты, присутствующие в цитоплазмой бактериальное, анализов количественных деятельности требуют очищенный протеин.
Очищение протеина хромотографией сродства металла тщательно охваченных литература2,3. Гистидин теги, состоящий из шести последовательных гистидина остатков, приложил к N – или C-конечная рекомбинантных белков позволяют быстрое очищение метал близость хроматографии4,5,6. Эти последовательности являются небольшими по сравнению с белками, они изменить и обычно имеют минимальное влияние на функции белка, хотя они могут иногда изменять стабильности белок фермента кинетики7,8. Гистидин теги в N – и C-Термини же протеина могут иметь различные эффекты, которые трудно предсказать, не зная структуры белка в вопросе. Гистидин теги обычно включаются во время клонирования рекомбинантных белков путем разработки грунты, которые кодируют шесть гистидина остатков, либо сразу 3′ для начала кодон ГПТ или сразу 5′ к стоп-кодон открытом чтения кадра. После усиления hexahistidine содержащие ген лигируют в вектор под контролем промотора индуцибельной и выразил, обычно в лаборатории штамм E. coli. Рекомбинация белок затем могут быть изолированы на близость смол, содержащих иммобилизованные двухвалентной катионов (обычно никель или кобальта)9. Загрязняя родной метал связывающих белков могут быть удалены путем титрования с имидазола, которое конкурсно вытесняет связанный протеин2. Наконец целевого белка этого eluted из столбца с более высокими концентрациями имидазола. Существует несколько коммерческих источников для иммобилизованных катиона металла смолы, и производители предоставляют рекомендации для буфера условий и концентрации имидазола. После элюции белка могут быть проанализирован натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE), dialyzed или сразу же использоваться в функциональных анализов.
Существует несколько способов косвенно контролировать активность протеинкиназы, связывая Бонд гидролиз АТФ фосфат второй реакции, которая выпускает или возбуждает Флюорофор или генерирует хемилюминесценции, но эти реакции имеют несколько движущихся частей и может быть технически сложных10. Наиболее простым способом конкретно измерить активность люминофор передача является непосредственно контролировать передачу radiolabeled фосфатной группы из коммерчески доступных γ –32-P предшественником NTP-radiolabeled субстрата11 , 12 , 13. смеси radiolabeled субстратов и продуктов могут быть разделены и количественно методом хроматографии (ТСХ) тонким слоем. TLC использует дифференциального мобильность растворенных веществ в данного растворителя, позволяя растворителя (жидкой фазы) для переноса капиллярность по всей поверхности (твердой фазы), после чего смесь растворов был адсорбированных14. Растворенных веществ, которые являются небольшими и/или отсутствие благоприятных взаимодействия с твердой фазы будет переносить большие расстояния от их первоначального расположения чем растворенных веществ с более высокой молекулярной массой или большой работоспособностью для тела. Для изучения люминофор передача фосфат постановление увеличить молекулярный вес молекул они добавляются и добавить отрицательный заряд ионных кислой или нейтральной рН11,12,14. Это снижает их мобильности на базовой поверхности, например Пей целлюлозы. Когда в кислой калия фосфатного буфера, смеси моно-, ди-, три-, тетра- и pentaphosphate видов могут быть легко разделены на ОПЭ целлюлозы, позволяя количественная оценка каждого вида (рис. 2, рис. 3). Такие анализы могут быть выполнены с помощью lysates клетки содержащие фермент интерес, но это включает в себя потенциал для деятельности других киназы, фосфатаз и общие ATPases к разрушающим субстрат или продукт. Для оценки количественных в vitro активность фермента необходимо очистить фермента интерес.
Гуанозина tetraphosphate (ppGpp) и pentaphosphate (pppGpp) гуанозина являются рибонуклеотид сигнальные молекулы, образованные передачи пирофосфат группа от прекурсор аденозинтрифосфатом (АТФ), соответственно, гуанозина дифосфат (ВВП) или гуанозина субстрата tetraphosphate (GTP)15. Эти сигналы одной рибонуклеотид, известные как ppGpp (p), посредником клетки широкий ответ экологического стресса, известный как строгие ответ в различных видов бактериальных,1516. Два сохранившихся классы ферментов катализируют образование (p) ppGpp15,17 Rel/Spo гомолога (RSH) ферментов являются «долго» бифункциональных (p) ppGpp синтетаза/гидролаз, назван в честь их сходство с реальными и SpoT (p) ppGpp метаболических ферменты от кишечной палочки , которые содержат синтетаза, гидролазы и нормативной областях, в то время как малые alarmone синтетазы (SAS) ферменты являются короткие монофункциональный синтетаз исключительно в грамм положительных бактерий15, 17 , 18. спорообразующих грамположительные бактерии Clostridium difficile кодирует предполагаемого RSH и SAS генов19. Здесь мы представляем первоначальный деятельность анализов, которые подтверждают, что фермент RSH C. difficile является каталитически активных синтетаза ppGpp (p).
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим очистки его меткой RSH от C. difficile и представит метод количественной оценки деятельности с использованием хроматографии radiolabeled тонким слоем. Этот метод использовался ранее для оценки активности ферментов циклазы diguanylate C. difficile, а также синтетаза ppGpp (p), циклазы ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась NIAID 1K22AI118929-01. EBP была поддержана летом исследовательский грант программы стипендий от управлением исследований в университете старого Доминиона, Норфолк, Виргиния, США.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
