体外培养肺泡上皮细胞中卤代气体浓度的控制方法
Summary
我们描述了一个简单的协议, 专门设计, 以达到精确和控制的浓度七氟醚或异氟醚在体外, 以提高我们对介入的机制在上皮性肺损伤的理解和测试小说急性呼吸窘迫综合征的治疗。
Abstract
急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 是一种弥漫性肺泡损伤, 肺泡液清除和严重炎症的综合征。使用卤代剂, 如七氟醚或异氟醚, 用于重症监护病房 (ICU) 的镇静, 可以改善气体交换, 减少肺泡水肿, 并在 ARDS 期间减弱炎症。然而, 在 ICU 中使用吸入剂进行持续镇静治疗或预防肺部损伤的数据缺乏。为了研究卤代剂在 “生理” 条件下对肺泡上皮细胞的影响, 我们描述了一种在气液界面培养细胞的简单系统, 并将其暴露在卤化剂中, 以提供精确控制的 “空气” 组分和这些制剂的 “中等” 浓度。我们开发了一个密封的气密室, 其中, 人肺泡上皮永生化细胞的板块可以通过麻醉机电路提供的连续气体流暴露于七氟醚或异氟醚的精确、控制的部分。细胞被暴露在4% 七氟醚和1% 的异氟醚24小时。采用气传质谱法测定了溶于培养基中的卤代剂浓度。在第一个小时后, 在培养基中的七氟醚和异氟醚的浓度分别为251毫克/升和25毫克/升。在培养基中溶解的七氟醚和异氟醚的浓度曲线显示了类似的课程随着时间的推移, 一个高原达到在一个小时后暴露。
本协议是专为达到精确和控制的七氟醚或异氟醚在体外的浓度, 以提高我们对在 ARDS 期间上皮性肺损伤的机制的理解, 并测试新的治疗综合 征。
Introduction
急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 是一种以弥漫性肺泡损伤、肺水肿、低氧性呼吸衰竭为特征的临床综合征。虽然 ARDS 代表10% 以上的重症监护病房 (icu) 招生和近25% 的 ICU 患者需要机械通气, 但它仍然是一个未被认可的挑战, 临床医生, 医院死亡率为 35-45%1。尽管进行了大量的研究, 但目前还没有发现有效的 ARDS 药物治疗或预防的方法。两个主要特征导致 ARDS 死亡率: 肺泡液清除 (AFC) 受损 (即肺泡水肿液从远端肺空域的改变吸收) 和严重炎症2。由于 ARDS 死亡率仍然很高, 目前的倡议还应包括初级预防;然而, 一个关键的挑战是找出高危患者, 其中 ards 可能发展和谁将受益, 如果 ards 被阻止。
挥发性卤化麻醉剂, 如七氟醚和异氟醚, 广泛用于在手术室内提供全身麻醉。在全球范围内, 每年有超过2.3亿名患者进行大手术, 需要全身麻醉和机械通气3, 术后肺部并发症对临床结果和医疗保健使用产生不利影响4.使用七氟醚代替异丙酚与改善胸部手术患者的肺部炎症有关, 并显著减少不良事件, 如 ARDS 和术后肺部并发症5。同样地, 异氟醚预处理对 ARDS6、7实验动物模型的呼吸力学、氧合和血流动力学有保护作用。虽然进一步的研究有必要解决吸入剂对非心脏手术结果的影响, 但最近在 meta 分析中观察到肺部并发症的类似减少, 表明吸入麻醉剂-作为反对静脉麻醉-与心脏手术死亡率的降低显著相关8。
关于使用挥发性药物用于 ICU 患者镇静预防或治疗肺部损伤的具体未来数据缺乏。然而, 现在有几个试验支持吸入七氟醚治疗 ICU 患者镇静剂的功效和安全性, 临床前研究表明, 吸入七氟醚和异氟醚7,9改善气体交换, 减少肺泡水肿, 并减弱炎症在 ARDS 的实验模型。此外, 七氟醚减轻 II. 型上皮细胞损伤10, 而异氟醚通过对紧密结蛋白11的调制维持肺泡毛细血管屏障的完整性。然而, 需要进行进一步的研究, 以验证吸入七氟醚和异氟醚的器官保护的实验证据在多大程度上可以转化为人类。本组第一个单中心随机对照试验 (RCT) 发现, 在 ARDS 患者早期使用吸入七氟醚与改善氧合、降低某些亲炎标志物水平和减少肺上皮有关由血浆和肺泡液中晚期糖基化终产物 (sRAGE) 受体可溶性形式的水平评定的损伤12。
综合考虑, 七氟醚和异氟醚对肺损伤的有益作用可能指向依赖于愤怒通路的多种生物通路或功能过程, 即肺泡流体清除 (AFC)、上皮损伤、核因子 (NF)-nf-κb 和巨噬细胞活化的易位。此外, 七氟醚可能影响愤怒蛋白本身的表达。自从我们的研究团队和其他人以前的研究支持在 ARDS 的肺泡炎症和肺上皮损伤/修复的关键作用, 我们设计了一个实验模型, 以提供对机制的翻译理解七氟醚在肺损伤和修复13,14,15。本文研究了一种新型的人肺泡上皮原代细胞系中七氟醚和异氟醚的体外作用, 目的是探讨外周肺 hAELVi (人肺泡上皮慢病毒) 的气-血屏障。永生化), 具有肺泡型 I 类特征, 包括功能性紧结16。
在准备我们的体外调查的设计 (例如,在空气-液体界面与暴露于 “吸入” 七氟醚或异氟醚的肺泡上皮细胞的文化, 我们理解从以前发表的研究,七氟醚的馏分仅在 “空气” 界面17、18、19使用标准监测器 (类似于临床设置中使用的) 进行评估。卤化剂浓度通常根据最低肺泡浓度 (MAC) 值 (例如,在人类中, 对于七氟醚, 0.5, 1.1 和 2.2 vol%, 分别代表0.25、0.5 和 1 MAC) 进行选择; 对于异氟醚、0.6、0.8 和1.3 vol% 分别代表0.25、0.5 和 1 MAC)20。事实上, 七氟醚和异氟醚浓度从未在培养基本身中进行过研究, 因此限制了以往实验模型/仪器的有效性。此外, 大多数实验都使用了在含有七氟醚的空气混合物被冲洗进去后密封的厌氧罐。由于我们的目标是研究肺泡上皮细胞在 “生理” 条件下, 我们认为这种厌氧状态可能不是最佳的, 不会与长期的实验时间相容。因此, 我们开发了自己的系统, 在空气-液体界面培养细胞, 并将它们暴露给卤代剂 (七氟醚和异氟醚), 目的是为这些制剂提供精确控制的 “空气” 组分和 “培养基” 浓度。在我们看来, 这一实验步骤, 这是尚未报告迄今在文献中, 是强制性之前, 任何进一步的体外调查七氟醚和异氟醚。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们的协议描述了一种简单的方法, 将细胞暴露在卤代麻醉剂的精确部分, 如七氟醚或异氟醚。此外, 我们在这里首次报告-在培养基本身中, 气体馏分与七氟醚和异氟醚浓度之间存在严格的相关性。这一基本步骤现在允许我们安全地使用我们的气密室来研究这些卤代剂在培养的人肺泡上皮细胞中的作用。
目前, 研究七氟醚在肺泡细胞中的作用的大多数科研小组使用的是先用卤化…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者承认, 奥弗涅区域理事会 (“新 Chercheur 一个涅” 2013) 和法国法新社谜和 séjour de 护理 (“方案 de 谜 Translationnelle en 桑特”ANR-13-PRTS-0010) 的赠款。出资人对研究设计、行为、分析或本文的编写没有影响。
Materials
| Sevoflurane | Baxter | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Isoflurane | Virbac | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Human Alveolar Epithelial cells | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| huAEC Medium (ready-to-use) | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| Anesthetic machine circuit | Drager | Fabius | |
| Gas analyzer | Drageer | Vamos Plus | |
| Anesthetic gas filter | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| Heated Humifier | Fisher&Paykel | MR850 | |
| Chamber | Curver | 00012-416-00 | |
| Gas chromatography coupled with mass detection | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| Fused-silica column (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID) | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
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