In Vitro Método de Control de concentraciones de Gases halogenados en cultivos de células epiteliales alveolares
Summary
Se describe un protocolo fácil diseñado específicamente para alcanzar precisas y controladas las concentraciones de sevoflurano o isoflurano en vitro con el fin de mejorar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la lesión pulmonar epitelial y poner a prueba la novela terapias para el síndrome de dificultad respiratoria aguda.
Abstract
Síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome de lesión alveolar difusa con deterioro separación líquido alveolar e inflamación severa. El uso de agentes halogenados, como el sevoflurano o isoflurano, para la sedación de pacientes de la unidad de cuidados intensivos (UCI) puede mejorar intercambio del gas, reducir el edema alveolar y atenuar la inflamación durante el SDRA. Sin embargo, se carecen de datos sobre el uso de agentes inhalados para continua sedación en la UCI para tratar o prevenir el daño pulmonar. Para estudiar los efectos de los agentes halogenados en las células epiteliales alveolares bajo condiciones “fisiológicas”, describimos un sistema fácil para células en cultivo en la interfase aire-líquido y exponerlos a agentes halogenados para proporcionar fracciones precisa “aire” y concentraciones de “medio” para estos agentes. Hemos desarrollado un compartimiento hermético sellado en el que las placas con células inmortalizadas epiteliales alveolares humanas pudieran estar expuestas a una fracción exacta, controlada de sevoflurano o isoflurano usando un flujo de gas continuo proporcionado por un circuito de la máquina anestésica. Las células fueron expuestas al 4% de sevoflurano y 1% de isoflurano durante 24 horas. Espectrometría de masas de gas se realizó para determinar la concentración de agentes halogenados, disuelto en el medio. Después de la primera hora, las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano en el medio fueron 251 mg/L y 25 mg/L, respectivamente. Las curvas que representan las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano disuelven en el medio demostrado cursos similares en el tiempo, con una meseta que alcanza en una hora después de la exposición.
Este protocolo fue diseñado específicamente para llegar a precisa y controladas las concentraciones de sevoflurano o isoflurano en vitro para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la lesión epitelial pulmonar durante el SDRA y probar nuevas terapias para el síndrome.
Introduction
Síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome clínico caracterizado por lesión alveolar difusa, edema pulmonar y la insuficiencia respiratoria hipoxémica. Aunque ARDS representa más del 10% de los ingresos de la unidad de cuidados intensivos (UCI) y casi el 25% de pacientes de la UCI que requieren ventilación mecánica, sigue siendo un reto poco reconocidos para los médicos, con una tasa de mortalidad del hospital de 35-45%1. A pesar de intensa investigación, la identificación de una terapia farmacológica eficaz de SDRA o de prevención ha fracasado hasta la fecha. Dos características principales contribuyen a la mortalidad en SDRA: problemas de separación líquido alveolar (AFC) (es decir, la alteración reabsorción del líquido de edema alveolar de espacios aéreos distales del pulmón) y la inflamación severa2. Puesto que la mortalidad de SDRA sigue siendo alta, iniciativas deberían incluir también la prevención primaria; sin embargo, un desafío clave es identificar a pacientes en riesgo de SDRA es propenso a desarrollar y que se beneficiarían si SDRA fueron prevenido.
Los anestésicos halogenados volátiles, como isoflurane, sevoflurane son ampliamente utilizados para proporcionar anestesia general en quirófano. En todo el mundo, más de 230 millones pacientes sometidos a cirugía mayor cada año requieren anestesia general y ventilación mecánica3, y las complicaciones pulmonares posoperatorias afectan los resultados clínicos y la utilización profesional de la salud4 . El uso de sevoflurano en vez de propofol se asoció con inflamación pulmonar mayor en pacientes sometidos a cirugía torácica y una disminución significativa en los eventos adversos, tales como SDRA y las complicaciones pulmonares posoperatorias5. Semejantemente, tratamiento previo con isoflurano tenía efectos protectores en la mecánica respiratoria, oxigenación y hemodinámica en modelos animales experimentales de ARDS6,7. Aunque otros estudios están garantizados a los efectos de agentes inhalados en los resultados en cirugía no cardiaca, una disminución similar en las complicaciones pulmonares se ha observado recientemente en un metanálisis, demostrando que inhalan agentes anestésicos, como se oponen a la anestesia intravenosa — están significativamente asociados con una reducción en la mortalidad por cirugía cardíaca8.
Carecen de datos prospectivos específicos sobre el uso de agentes volátiles para la sedación de pacientes de la UCI para prevenir o tratar el daño pulmonar. Sin embargo, varios ensayos ahora apoyan la eficacia y seguridad del inhalado sevoflurane para la sedación de pacientes de la UCI, y los estudios preclínicos han demostrado que sevoflurano inhalado e isoflurano7,9 mejorar intercambio del gas, reducir edema alveolar e inflamación atenuada en modelos experimentales de SDRA. Además, sevoflurano reduce tipo II célula epitelial daño10, mientras que el isoflurano mantiene la integridad de la barrera del alveolar-tubo capilar a través de la modulación de la proteína de Unión estrecha11. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para verificar hasta qué punto la evidencia experimental de protección de órgano de inhalado sevoflurane e isoflurano podría traducirse a los seres humanos. Un primer centro único controlado-Estudio aleatorizado (ECA) de nuestro grupo encontró que el uso temprano del sevoflurane inhalado en pacientes con SDRA se asoció con mayor oxigenación, disminución en los niveles de algunos marcadores pro-inflamatorias y epiteliales de pulmón reducida daño, según lo determinado por los niveles de la forma soluble del receptor de productos finales de glicación avanzada (sRAGE) en fluido alveolar y plasma12.
Tomados en conjunto, los efectos beneficiosos de sevoflurano y el isoflurano en la lesión pulmonar podrían apuntar a múltiples caminos biológicos o procesos funcionales que dependen de la vía de la rabia, es decir, separación de fluido alveolar (AFC), lesiones epiteliales, translocación del factor nuclear (NF)-κB y activación de los macrófagos. Además, sevoflurano puede influir en la expresión de la proteína de la rabia misma. Ya que investigaciones anteriores de nuestro equipo de investigación y otros soporta papeles fundamentales para rabia en inflamación alveolar y pulmonar lesiones epiteliales y reparación durante el SDRA, se diseñó un modelo experimental para proporcionar una comprensión aplicada de los mecanismos de sevoflurano en pulmonar lesión y reparación13,14,15. Se investigaron los efectos en vitro de sevoflurano y el isoflurano en una línea de células epiteliales alveolares humanas novela primaria diseñada específicamente para el estudio de la barrera aire sangre de la periferia del pulmón, hAELVi (humano LentiVirus epitelial Alveolar inmortalizadas), con características de-como de tipo alveolar incluyendo uniones estrechas funcional16.
Preparando el diseño de nuestras investigaciones en vitro (p. ej., cultivos de células epiteliales alveolares en la interfase aire-líquido con la exposición “inhalado” sevoflurano o isoflurano, entendimos de previamente publicado estudios que fracciones de sevoflurano sólo han sido evaluados en el “aire” interfaz17,18,19 con los monitores estándar (similares a los utilizados en un ajuste clínico). Concentraciones de agente halogenado se eligieron generalmente según los valores de la concentración alveolar mínima (MAC) (por ejemplo, en los seres humanos, para sevoflurane, 0.5, 1.1 y 2.2 vol %, que representa el 0.25, 0.5 y 1 MAC, respectivamente; para isoflurano, 0.6, 0.8, y vol 1,3% que representan 0.25, 0.5 y 1 MAC, respectivamente)20. De hecho, las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano nunca han sido investigadas en el medio de cultivo, lo que limita la validez de los anteriores modelos experimentales e instrumentos. Además, mayoría de los experimentos utiliza un recipiente de anaerobios que fue sellado después de que el aire mezcla con sevoflurane había salido dentro. Como nuestro objetivo era estudiar las células epiteliales alveolares bajo condiciones “fisiológicas”, creímos que tal un estado anaerobio puede no ser óptima y no sería compatible con duraciones de tiempo experimentales. Por lo tanto, hemos desarrollado nuestro propio sistema de células en cultivo en la interfase aire-líquido y exponerlos a agentes halogenados (sevoflurano y el isoflurano) con el objetivo de proporcionar exacta fracciones controlada “aire” y “medio” concentraciones de estos agentes. En nuestra opinión, este paso experimental, que no se ha divulgado hasta la fecha en la literatura, es obligatorio antes de cualquier otras investigaciones en vitro de sevoflurano y el isoflurano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro protocolo describe un método sencillo para exponer las células a una fracción exacta de un agente anestésico halogenado, como el sevoflurano o isoflurano. Además, se presenta aquí, por primera vez — una correlación rigurosa entre la fracción de gas y la concentración de sevoflurano y el isoflurano en el medio de cultivo propio. Este paso fundamental ahora nos permite poder usar nuestra cámara hermética para estudiar los efectos de estos agentes halogenados en una monocapa de cultivo de células epite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el Consejo Regional de Auvernia (“programa Nouveau Chercheur de la Région Auvernia” 2013) y la francesa Agence Nationale de la Recherche y la dirección Générale de L’Offre de Soins (“programa de Translationnelle de Recherche en Santé” ANR-13-PRTS-0010) para las becas. Los patrocinadores no tenían ninguna influencia en el diseño del estudio, la conducta y el análisis o en la preparación de este artículo.
Materials
| Sevoflurane | Baxter | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Isoflurane | Virbac | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Human Alveolar Epithelial cells | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| huAEC Medium (ready-to-use) | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| Anesthetic machine circuit | Drager | Fabius | |
| Gas analyzer | Drageer | Vamos Plus | |
| Anesthetic gas filter | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| Heated Humifier | Fisher&Paykel | MR850 | |
| Chamber | Curver | 00012-416-00 | |
| Gas chromatography coupled with mass detection | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| Fused-silica column (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID) | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
References
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