Hier presenteren we een directe intrathecale injectietechniek gebruik van 1% lidocaïne waterstofchloride in een virale oplossing om te zorgen voor efficiënte adeno-associated virus levering aan kleine dieren en een scoresysteem te voorspellen transductie efficiëntie in het midden zenuwstelsel volgens de graad van tijdelijke zwakte veroorzaakt door lidocaïne.
Intrathecale (IT) injectie van adeno-associated virus (AAV) heeft veel belangstelling in de therapie van het gen van de CNS uit hoofde van haar veiligheid, noninvasiveness en uitstekende transductie werkzaamheid getrokken in het VNV. Eerdere studies hebben aangetoond de therapeutische werkzaamheid van gentherapie AAV-geleverd in neurodegeneratieve aandoeningen door het bestuur. Echter zijn hoge tarieven van onvoorspelbare falen als gevolg van de technische beperking van IT-beheer in kleine dieren gemeld. Hier, wij opgericht een scoresysteem om aan te geven van de omvang van het succes van Lumbaalpunctie in kleine dieren door 1% lidocaïne waterstofchloride toe te voegen in de injectie-oplossing. Verder laten we zien dat de omvang van de tijdelijke zwakte na injectie de signaaltransductie efficiëntie van AAV kan voorspellen. Dus, is dit IT injectie methode kan worden gebruikt voor het optimaliseren van therapeutische proeven in muismodellen van CNS ziekten die grote regio’s van de CNS teisteren.
AAV langdurige en wijdverbreide genexpressie in de signaaltransductie CNS met weinig bijwerkingen kan bemiddelen, en daarom is uitgegroeid tot een van de meest veelbelovende voertuigen voor gentherapie om CNS ziekten met inbegrip van Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Huntington van te behandelen ziekte (HD), de ziekte van Alzheimer (AD), opslag Lysosomale ziekten (LSD), de ziekte van Gaucher (GD) en neuronale ceroid lipofuscinose (NCL)1. Momenteel werden meer dan 100 AAV serotypen geïsoleerd van mens en dier. Onder deze, ten minste 12 zijn gebruikt in preklinische en klinische proeven, met inbegrip van de meest gebruikte gebruikt gene vectoren zoals AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 en rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Verschillende CNS aandoeningen vereisen verschillende strategieën van de levering van de AAV als gevolg van de verschillende getroffen regio’s van de CNS en celtypes. De CNS regio’s en de cel typen die AAV kan transduce is afhankelijk van het serotype evenals leveringsmethode. RAAVrh10 heeft bijvoorbeeld aangetoond dat transduce overwegend astrocyten wanneer geleverd door systemische intraveneuze injectie (IV), terwijl het getransduceerde neuronen én glia wanneer geleverd door intrathecale injectie4,7. Bovendien resulteerde parenchym injectie in lokale transductie tot de omgeving van de injectieplaats, overwegende dat de injectie in de cerebrospinale vloeistof (CSF) via intraventricular of intrathecale injectie in wijdverbreide CNS transductie8 resulteerde . Studies hebben ook aangetoond therapeutische werkzaamheid van gentherapie in neurodegeneratieve aandoeningen AAV-geleverd door beheer9,10,11. Ziekten die invloed hebben op gebieden van het centraal zenuwstelsel zoals ALS, intrathecale injectie in het CB gebleken ter dekking van de meeste gebieden die zijn getroffen door de ziekte met een lagere dosis, in vergelijking met een systemische levering methode4,10. Recente studies hebben ook aangetoond dat Lumbaalpunctie kan worden gebruikt voor het injecteren van AAV in Muismodellen voor ALS, die mogelijke verwondingen laminectomie en intrathecale catheterisatie4is gekoppeld vermijdt.
Experimentele directe Lumbaalpunctie werd eerst gebruikt voor agenten, vooral anesthetica, naar het ruggenmerg voor analgesie en verdoving in 188512,,13. In dit verslag illustreren we de lumbale punctie IT injectie methode in volwassen muizen met behulp van 1% lidocaïne hydrochloride, een lokale amide afkomstige verdovingsmiddel, in de injectie-oplossing te evalueren en controleren van de kwaliteit van de injectie. Succesvolle injecties werden gekenmerkt door lidocaïne-geïnduceerde tijdelijke verlamming, overwegende dat mislukte injecties geen dit gedrag vertonen. We ingedeeld het niveau van voorbijgaande zwakte als één van de vijf klassen om te helpen de efficiëntie van de injectie te voorspellen. Tot slot laten we zien dat het niveau van de transductie rAAVrh10 kan worden voorspeld door de rang van verlamming. Daarom is deze methode voor het bezorgen van de intrathecale AAV inzetbaar verbeteren AAV-gemedieerde gen-voor experimentele therapie van CNS ziekten.
Technisch, zijn er verschillende kritische stappen tijdens de injectie van de IT in wakker muizen. Eerste, goede gebaar en firma controle van de muizen gedurende de hele operatie is een voorwaarde voor succesvolle levering. Ten tweede is het moeilijkste punt de lat. ruimte met de naald tip, gevoel als er moet niet te diep invoegen zonder weerstand of invoegen onder dwang onder sterke weerstand in het geval van de dieren verwonden of buigend van de naald-tip. Ten derde, hoewel de tijdelijke verlamming als gevolg van lidoc…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van HEBEI provinciale afdeling van menselijke hulpbronnen en sociale zekerheid (CY201605) en een subsidie van Natural Science Foundation Hebei provincie (H2017206101), en we zijn zeer dankbaar Dr Guangping Gao, die de AAV voor Deze studie.
FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
Goat serum | Solarbio | S9070 | |
Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
NaCl | Yong Da Chemical | ||
NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
70% Ethanol | WEN ZHI | ||
Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
1mL syringe | Hong Da | ||
Microtubes | Plasmed | ||
Micropipet | eppendorf | ||
Peppet tips | Rainin | ||
Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
Regerator | Haier | BCD-539WT | |
Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
Microscope | Olympus | BX53 | |
Freezing-microtome | Leica | CM1520 |