Kristallstruktur des N-terminale Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Plutella xylostella
Summary
In diesem Artikel beschreiben wir die Protokolle der Proteinbestimmung Ausdruck, Reinigung, Kristallisation und Struktur der N-terminalen Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Diamondback Moth (Plutella Xylostella).
Abstract
Entwicklung von potenten und effiziente Insektiziden gezielt Insekt Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) wurde von großem Interesse im Bereich der landwirtschaftlichen Schädlingsbekämpfung. Bis heute mehrere Diamide Insektizide targeting Pest, die RyRs in den Handel gebracht worden sind, generieren, die jährlichen Umsatz von 2 Milliarden US-Dollar. Aber Verständnis für die Wirkungsweise von RyR Zielversionen Insektiziden ist begrenzt durch den Mangel an strukturellen Informationen über Insekt RyR. Dies schränkt im Gegenzug Verständnis für die Entwicklung von Insektizid Widerstand in Schädlinge. Die Diamondback Moth (DBM) ist eine verheerende Pest zerstören Kreuzblütler Kulturen weltweit, die auch berichtet wurde, Widerstand gegen Diamide Insektizide zu zeigen. Daher ist es von großer praktischer Bedeutung, neuartige Insektizide, die Ausrichtung der DBM RyR, vor allem auf eine Region, die anders als die traditionelle Diamide-Bindungsstelle zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die N-terminale Domäne von RyR von DBM strukturell zu charakterisieren. Die Röntgen-Kristallstruktur wurde gelöst durch molekulare Ersatz mit einer Auflösung von 2,84 Å, die zeigt, ein Beta-Kleeblatt Falten Motiv und eine flankierende Alpha-Helix. Dieses Protokoll kann in der Regel für den Ausdruck, Reinigung und strukturelle Charakterisierung von anderen Domänen oder Proteine angepasst werden.
Introduction
Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) sind spezifische Ionenkanäle, die die Permeation von Ca2 + -Ionen über den sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membranen in den Muskelzellen zu vermitteln. Daher spielen sie eine wichtige Rolle in der Erregung Kontraktion Kupplung Prozess. In seiner funktionalen Form RyR montiert wie ein Homo-Tetramer mit einer Molekülmasse von > 2 MDa mit jeder Untereinheit, bestehend aus ~ 5000 Aminosäurereste. Bei Säugetieren, gibt es drei Isoformen: RyR1 – Skelettmuskulatur Typ, Herzmuskel Typ RyR2- und RyR3-ubiquitär in verschiedenen Geweben1ausgedrückt.
Bei Insekten gibt es nur eine Art von RyR, das Muskel- und Nervensystem Gewebe2ausgedrückt wird. Insekt RyR ist ähnlicher Säugetier RyR2 mit einer Sequenz-Identität von etwa 47 %3. Diamide Insektizide targeting RyR Lepidoptera und Coleoptera entwickelt und vermarktet von Großunternehmen wie Bayer (Flubendiamid), DuPont (Chlorantraniliprole) und Syngenta (Cyantraniliprole). Seit relativ kurzer Zeit sind Diamide Insektizide eines der am schnellsten wachsende Klasse von Insektiziden geworden. Derzeit haben die Verkäufe von diesen drei Insektizide jährlich 2 Milliarden US-Dollar mit einer Wachstumsrate von mehr als 50 % seit 2009 (Agranova) überschritten.
Jüngste Studien haben die Entwicklung von Resistenzen bei Insekten nach wenigen Generationen der Nutzung dieser Insektizide4,5,6,7,8berichtet. Die Resistenzmutationen in der transmembrane Domäne des RyRs aus der Diamondback Moth (DBM), Plutella Xylostella (G4946E, I4790M) und die entsprechenden Positionen in Tomaten-Leafminer, Tuta Absoluta (G4903E, I4746M) zeigen, dass die region könnte Diamide Insektizid Bindung beteiligt sein, da diese Region bekannt ist kritisch für die Anspritzung von Channel4,8,9. Trotz umfangreicher Forschung in diesem Bereich bleiben die genauen molekularen Mechanismen der Diamide Insektizide schwer. Darüber hinaus ist unklar, ob die Resistenzmutationen Interaktionen mit Diamides direkt oder allosterically betreffen.
Frühere Studien haben berichtet, die mehrere Domänen RyR Säugetierarten und Struktur in voller Länge Säugetier-RyR1 und RyR2 durch Röntgen-Kristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie, bzw.10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Aber bisher keine Struktur des Insekts RyR wurde berichtet, das verbietet uns vom Verständnis der molekularen Feinheiten der Rezeptor-Funktion sowie die molekularen Wirkmechanismen Insektizid und Insektizid Resistenzentwicklung.
In diesem Manuskript präsentieren wir eine generalisierte Protokoll für die strukturelle Charakterisierung der N-terminale β-Kleeblatt-Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Diamondback Moth, zerstörerischen Schädling infiziert Kreuzblütler Kulturen weltweit22. Das Konstrukt wurde nach den veröffentlichten Kaninchen RyR1 NTD Kristall Strukturen23,24, Cryo-EM Strukturmodellen16,17,18,19, entwickelt. 20 , 21. Dies ist die erste hochauflösende Struktur für Insekt RyR, die zeigt des Mechanismus für die Anspritzung Kanal und stellt eine wichtige Vorlage für die Entwicklung der artspezifischen Insektizide mit Struktur-basierte Wirkstoffdesign gemeldet. Für die Strukturaufklärung beschäftigten wir Röntgen-Kristallographie, die als “Goldstandard” für Protein Strukturaufklärung an in der Nähe von atomarer Auflösung gilt. Obwohl die Kristallisation unberechenbar und arbeitsintensiv ist, wird dieser Schritt für Schritt-Protokoll den Forschern helfen, zum Ausdruck bringen, zu reinigen und zu anderen Domänen von Insekten RyR oder andere Proteine im Allgemeinen zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel beschreiben wir das Verfahren um rekombinant express, reinigen, kristallisieren und bestimmen die Struktur der DBM RyR NTD. Für die Kristallisation ist eine entscheidende Voraussetzung um Proteine mit hohen Löslichkeit, Reinheit und Homogenität zu erhalten. In unserem Protokoll haben wir pET-28a-HMT Vektor verwenden, denn es enthält ein Hexahistidine Tag und MBP-Tag, die genutzt werden könnte, für Reinigung, eine höhere Falte Reinheit zu erhalten. Darüber hinaus die MBP-Tag hilft in der Löslich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung dieser Forschung von zur Verfügung gestellt wurde: National Key Research und Development-Programm aus China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), National Nature Science Foundation of China (31320103922, 31230061) und Projekt des nationalen Grundlagenforschung (973) Programm der China (2015CB856500, 2015CB856504). Wir sind dankbar für das Personal auf das Strahlrohr BL17U1 bei Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
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