Tau aggregering analysen beskrivs i detta manuskript härmar de förvänta funktionerna i vivo Skellefteåsjukan tau och aggregering.
Sammanläggning av tau-protein och bildandet av Parade spiralformade filament är ett kännetecken för Alzheimers sjukdom och andra tauopathies. Jämfört med andra proteiner som är associerad med neurodegenerativa sjukdomar, rapporterade in vitro- aggregering kinetiken för tau-protein är mindre konsekvent presenterar en relativt hög variabilitet. Här beskriver vi utvecklingen av en in vitro- aggregering analysmetod som härmar de förväntade stegen i samband med tau Skellefteåsjukan och aggregation i vivo. Analysen använder den längsta tau isoform (huTau441) som innehåller både N-terminala sura skär samt fyra mikrotubulära bindande domäner (MBD). In vitro- aggregering utlöses genom tillsats av heparin och följs kontinuerligt av Tioflavin T fluorescens i 96 väl mikroplattan format. Tau aggregering analysen är mycket reproducerbara mellan olika brunnar, experimentell körningar och partier av proteinet. Aggregeringen leder till tau PHF morfologi som är mycket effektiv i sådd bildandet av de novo fibrillar strukturer. Förutom sin ansökan för att studera mekanismen för tau Skellefteåsjukan och aggregering, är aktuella analysen ett robust verktyg för screening av läkemedel som kan störa patogenesen av tau.
Alzheimers sjukdom är en förödande neurodegenerativ sjukdom som definieras histopatologiskt av ansamling av extracellulära senila plack av aggregerade Amyloid beta1 och intracellulära neurofibrillära trassel som innehåller aggregerade hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiska tau är monomer och presenterade som sex unika isoformer som innehåller 0-2 N terminal skär och 3 eller 4 mikrotubulära bindande domäner3,4 uppkommer alternativ splitsning och ett genomsnitt på 2-3 phosphorylations. Det tros att hyperphosphorylation, Skellefteåsjukan och själv aggregering i fibrillary strukturer utgör nyckelelementen i tau patogenes, bedömdes patologiskt i dementa personer5,6.
De aggregerade neurofibrillära tau tovor är ett kännetecken inte bara för AD, men också för andra tauopathies, däribland frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Picks sjukdom, Progressiv Supranukleär pares (PSP), fronto-temporal demens (FTD) och primär åldersrelaterade tauopathy (del)2. Från en biokemisk synvinkel, förstå mekanismen av tau Skellefteåsjukan och aggregering kunde belysa patologiska processer i samband med AD och andra tauopathies. Förutom den vetenskapliga aspekten finns robust in vitro- aggregering analyser värdefulla verktyg för screening av drogen kandidater7,8,9,10. Det tros att sammanläggning av tau följer en kärnbildning beroende polymerisation process (NDP)11,12,13,14. NDP kinetik är sigmoidal och börjar med ett energetically unfavorable kärnbildning steg följt av en snabb energiskt utförsåkning aggregering process.
Till skillnad från andra amyloidogenic proteiner, inklusive prionproteinet, beta-amyloid och α-synuclein, tau spontant samlade inte under fysiologiska betingelser och även extrema pHs eller höga temperaturer är icke-främjar för sammanläggning15. Detta beror troligen på de hydrofila interaktionerna i gränssnittet tau aggregering. Dock aggregerar tau effektivt vid fysiologiska koncentrationer när inducerare såsom heparin16 eller andra polyanions17,18 används.
Tidigare insatser för att ställa in vitro- tau aggregering analyser har kasta lite ljus på detaljerna tau Skellefteåsjukan och aggregering, men de kom kort att härma vad som tros vara i vivo tau aggregering kinetik. I de flesta fall saknades de tau aggregation kineticsen den inledande lag fasen är associerad med tau kärnbildning. Detta kan ha varit följden av med mycket hög tau protein koncentrationer, förekomsten av aggregat i Start tau protein förberedelserna och/eller användning av tau fragment med mycket högre aggregeringsnivå benägenhet än den mer fysiologiska full längd-tau protein19,20,21,22,23. Dessutom upp tidigare studier inte den reproducerbarhet och robusthet aspekt av tau aggregation kinetics.
Här beskriver vi ett robust in vitro- tau aggregering test som härmar de viktigaste egenskaperna hos en kärnbildning beroende polymerisation med en inledande lag fasen motsvarar tau kärnbildning följt av en exponentiell tillväxtfas. Dessutom genererade rekombinant tau aggregaten är fibrillar i naturen och har en extremt hög sådd potens. Analysen är mycket reproducerbara också mellan tau batchar och utgör ett värdefullt verktyg att skärmen för aggregering hämmare.
Trots många försök, de tau aggregation kineticsen rapporterats i litteraturen att datum saknas önskad nivå av reproducerbarhet och/eller några av funktionerna en kärnbildning beroende polymerisation19,20,21 , 22 , 23 , 25. Detta framhävs ofta av bristen på en eftersläpning fas, ineffektiva sådd och icke-fibrillar natur av tau aggregat. Orsaken till dessa brister kan variera och inkluderar suboptimala tau proteinkvalitet (fragmentering, förekomsten av aggregat, låg renhet osv.), val av protein och förmå reagenser och eller experimentella förhållanden. En annan komplicerande faktor är två cystein rester ligger runt tau aggregering gränssnittet som kan bilda intra – eller inter – molekylär disulfide broar beroende på redox miljö och påverkar effektiviteten av tau aggregation. I de flesta metoder att minska reagens såsom DTT eller TCEP har använts för att bibehålla cystein rester i reducerade former och därmed öka nivåer av reproducerbarhet25. En extinktionskoefficient Tau är dessutom mycket låg vilket leder till svårigheter med noggranna mätningar av proteinkoncentration.
Vi fokuserade särskilt på några parametrar och kvalitetsattribut som vi ha avgörande betydelse för en robust, reproducerbar och representativa aggregering profil för tau-protein: att eliminera möjligheten av intra – och inter-molekylär disulfid bildande, Generera en högt rena tau monomer och förbättra koncentration beslutsamhet noggrannhet. Alla dessa reagens relaterade frågor är potentiella uppmärksamhet punkter som vi ansåg kritiska för optimal analys utveckling. För att lösa dessa frågor, uttrycktes full längd huTau441 med två mutationer, C291A och C322A, och N – och C-terminal taggar. Mutation av cystein rester har minimal påverkan på tau protein samtidigt som det eliminerar den annars mycket svårt att styra disulfid överbrygga. Uttrycker proteinet med relativt kort N – och C-terminal Taggar tillät oss att fullfölja en två-stegs affinitet rening protokollet vilket ledde till mycket hög renhet, integritet och monomer innehåll. Dessutom presenterade vi en F8W-mutation som ökade extinktionskoefficient av protein och får mycket mer exakt koncentration mätningar24.
Förutom att använda högkvalitativt protein reagenser, var andra assay parametrar också optimerad. Den optimala tau: heparin baserat identifierades för att vara runt 0,5 (M/M) som är i linje med tidigare publicerade studier26. Mekaniska och optiska instrumental inställningar är dessutom avgörande att säkerställa reproducerbarhet och de optimala parametrarna skiljer sig till viss del beroende på tillverkaren.
Sammanläggning av tau som beskrivs i denna analys visar egenskaper som är associerade med tau patogenes i AD och relaterade tauopathies. Processen börjar med en inledande lag fasen motsvarar bildandet av hög energi kärnor och följs av en snabb tillväxtfas som motsvarar till fibrill tillväxt. Lagfasen är tillräckligt lång för att öppna ett brett fönster för att i detalj studera sådd processen som täcker ett brett spektrum av utsäde koncentrationer (figur 5) medan fortfarande inte alltför länge så proteinnedbrytning och/eller icke-specifik aggregering undviks (figur 2). dessa sekundära händelser kan speciellt hända när ett intimt oordnade protein såsom huTau441 utsätts för långa tidsperioder att fysiologiska förhållanden. Erhållna tau aggregat displayen morfologi av PHFs isolerade från hjärnan hos AD patienter och är mycket effektiva i att rekrytera monomer tau och konvertera den till de novo genereras aggregat, en process som kallas sådd. Analysen är mycket reproducerbara, kinetic kurvorna att vara praktiskt taget omöjlig att skilja mellan brunnar, experimentell körningar och protein partier. Även om den aktuella analysen fokuserar endast på den längsta tau isoformen, huTau441, programmet kan anpassas för att studera omvandlingen av andra former av tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikation, i pressen) Dessutom gör det möjligt mekanistiska studier fokuserar på samspelet mellan tau isoformer och eventuellt belysa skillnaderna mellan tau patogenes i AD där både 3R och 4R isoformer är närvarande i PHFs och Picks sjukdom eller Frontotemporal demens där tau patologi innehåller huvudsakligen 3R och 4R tau-isoformer, respektive27.
Mycket hög reproducerbarhet av analysen bör tillåta läsarna att genomföra det med relativ lätthet i sina specifika lab inställningar. Analysens härmar vad som tros vara i vivo Skellefteåsjukan och aggregering av tau, aktivera mekanistiska studier som kommer att belysa tau patogenes och det utgör ett värdefullt verktyg för screening läkemedelskandidater och utvärdera deras inblandning med de olika stegen i processen patogenes.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Hector Quirante för uttryck och rening av huTau441, Hanna Inganäs och Margot van Winsen för utmärkt teknisk support och Martin Koldijk för dataanalys.
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |