Ingeniería de genoma CRISPR Cas9 basado en generar modelos de Jurkat reportero para infección por VIH-1 con los sitios seleccionados integración Proviral
Summary
Presentamos un flujo de trabajo de ingeniería de genoma por la generación de nuevos modelos in vitro para la infección por VIH-1 que recapitular integración proviral en sitios genómicos. Ataques contra reporteros derivados del VIH es facilitada por la manipulación del genoma mediada por Cas9 CRISPR, site-specific. Cuentan con protocolos detallados unicelular clon generación, detección y verificación dirigida a corregir.
Abstract
Virus de inmunodeficiencia humana (VIH) se integra su ADN proviral en el genoma celular de host en sitios recurrentes y puntos calientes genómicas no-al azar. Aquí presentamos un protocolo detallado para la generación de nuevos modelos in vitro para la infección por el VIH con los sitios de integración genómica solicitadas usando tecnología ingeniería CRISPR Cas9 basado en genoma. Con este método, una secuencia de reportero de elección puede integrarse en un locus genómico específico, solicitado, reflejando sitios clínicamente relevantes de la integración.
En el protocolo, el diseño de un reportero derivados del VIH y la elección de una secuencia Diana de sitio y gRNA se describen. Un vector apuntado con armas de homología se construye y transfected en las células de Jurkat T. La secuencia del reportero está dirigida al sitio genómico seleccionado por recombinación homóloga facilitado por una rotura de doble cadena mediaron Cas9 en el sitio de destino. Sola célula clones generadas y proyectadas para apuntar eventos por citometría de flujo y PCR. Clones seleccionados se expanden, y orientación correcta se verifica mediante PCR, secuenciación y borrar meridional. Se analizan los potenciales eventos fuera del objetivo de la ingeniería del genoma mediada por Cas9 CRISPR.
Mediante el uso de este protocolo, sistemas de cultivo celular novela puede generarse la infección por VIH modelo en sitios clínicamente relevantes de la integración. Aunque la generación de clones de unicelular y verificación de integración de secuencia correcto periodista son desperdiciador de tiempo, las líneas clonales que son herramientas poderosas para analizar funcionalmente la elección del sitio de integración proviral.
Introduction
Integración del ADN proviral en el genoma del anfitrión a la infección es un paso crítico en el ciclo vital del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Tras la integración, el VIH persiste mediante el establecimiento de latencia en subconjuntos de células T CD4 + duraderos como células de memoria T CD4 +. Integración del VIH parece ser no-al azar1,2. Un número de hotspots genomic ADN proviral integrado recurrentemente se ha detectado en varios estudios a través de la secuenciación de los sitios de integración en los individuos infectados agudo y crónico2,3,4 ,5,6,7,8. Curiosamente, en algunos de estos sitios de integración, mismo lugar geométrico fue detectado en una gran parte de las células infectadas, llevando a la idea de que integración en sitios recurrentes podría afectar positivamente la extensión clónica1.
Para avanzar en nuestra comprensión de la importancia de los sitios de integración recurrente, elección del sitio de integración proviral debe ser explorada. Sin embargo, varios aspectos técnicos dificultan integración VIH estudio sitio de elección y las consecuencias. Ampliamente utilizado modelos de cultivo celular para la latencia del VIH como líneas de celulares JLat no reflejan integración recurrente clínicamente relevantes sitios9. Estudios sobre las células primarias derivados del paciente, por un lado, permiten la descripción del paisaje del sitio de integración por la secuencia pero no permiten análisis funcionales. A nuestro conocimiento, no hay un modelo experimental adecuado está disponible para analizar funcionalmente las sitios de integración clínicamente relevantes.
Aquí presentamos un detallado flujo de trabajo para generar nuevos modelos para la infección por VIH utilizando tecnología ingeniería CRISPR Cas9 basado en genoma. El flujo de trabajo descrito en este documento se puede utilizar para generar líneas de células de reportero derivados de la célula de T que la infección por VIH, llevando un reportero proviral genómicamente integrado en un sitio elegido de la integración del modelo. Por lo tanto están sirviendo como herramientas para explorar cómo el sitio de integración proviral puede afectar Biología del VIH y cómo el provirus responde a diferentes estrategias de tratamiento (p. ej., inducibilidad de, por los agentes de inversión de latencia). Nuestro método utiliza las ventajas de la ingeniería CRISPR Cas9 basado en genoma, en que integración del reportero de secuencia por la recombinación homóloga es facilitado por una rotura de doble cadena inducida por la nucleasa de Cas9 en el sitio de destino. Sitios de destino para su integración son seleccionados según la proximidad a los sitios de integración recurrente descrito de los estudios en personas infectadas por el VIH y la presencia de motivos de PAM adecuados para la ingeniería del genoma mediaron Cas9.
En los resultados de nuestros ejemplares, nos hemos centrado en el BACH2 Lugar geomtrico del gene, que codifica el regulador transcripcional de BTB y homología de CNC 2. En los individuos crónicamente infectados por el VIH en tratamiento antirretroviral, BACH2 es uno de los lugares geométricos que enriquecimiento del integrado VIH-1 secuencias3,6,7,8,10. Hemos elegido mínimo derivados del VIH reportero de VIH-1-derivado largo terminal de repetición (LTR), secuencia de codificación de tdTomato y hormona de crecimiento bovino (BGH) señal de poliadenilación (PA), nos hemos dirigido a dos sitios específicos en el BACH2 intrón 5. El protocolo presentado está optimizado para Jurkat células, una humana CD4 + línea celular derivada de la célula de T de la suspensión, pero otras células pueden utilizarse líneas y el protocolo adaptado en consecuencia. Presentamos un detallado flujo de trabajo para la selección del sitio de destino, construcción del vector blanco con brazos de homología, CRISPR Cas9-mediada por ataques contra el reportero en el lugar escogido genómica, generación y selección de líneas clonales y completa de verificación de líneas celulares de reportero recién generada, destino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un protocolo para generar modelos de reportero de VIH-1-derivadas de Jurkat con sitios de integración proviral elegido aplicar ingeniería CRISPR Cas9 basado en genoma.
Varios puntos del protocolo requieren especial atención durante la fase de planificación. En primer lugar, el lugar geométrico de a debería ser elegido cuidadosamente, como algunos loci podrían ser más fáciles al destino que otros (por ejemplo,, dependiendo del estado de la cromatina de la re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Britta Weseloh y Bettina Abel para asistencia técnica. También agradecemos a Arne Düsedau y Jana Hennesen (plataforma de tecnología de citometría de flujo, Instituto de Heinrich Pette) para obtener asistencia técnica.
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
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