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Biochemistry

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

Published: October 19, 2018
doi:
10.3791/58580
, , ,
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University

Summary

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

Abstract

RNA 의무적인 단백질 (RBPs)의 포괄적인 식별 셀에 posttranscriptional 규제 네트워크를 이해 하는 열쇠입니다. RBP 캡처에 대 한 널리 사용 되는 전략은 polyadenylation [많은] 대상 RNAs의 미확인 non-poly(A) RNAs의 대부분 바인딩 단백질을 떠나 진 성숙한 mRNAs에 주로 발생 하는 이용 한다. 여기 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC)의 대사 라벨을 결합 하 여 많은 non-poly(A) RBPs transcriptome 전체 캡처를 가능 하 게 되 나 최근 보고 된 방법의 자세한 절차 설명 RNAs vivo에서 UV cross-linking, 그리고 bioorthogonal 태그.

Introduction

인간 게놈은 코딩 및 noncoding RNAs (ncRNAs), mRNAs, rRNAs tRNAs, 작은 핵 RNAs (snRNAs), 작은 nucleolar RNAs (snoRNAs), 그리고 긴 비 코딩 RNAs (lncRNAs)1의 다양 한 형식으로 복사할 수 있습니다. 대부분 이러한 RNAs의 RBPs의 의류를 보유 하 고 ribonucleoprotein 입자 (RNPs)2로 작동. 따라서 RBPs의 포괄적인 식별 다양 한 인간 질병3,,45에 연루 RNAs 사이의 RBPs, 규제 네트워크를 이해 하기 위한 전제 조건입니다.

지난 몇 년 동안 다양 한 진 핵 시스템2,6, 인간의7,,89,10,11를 포함 하 여 발견 RBPs의 큰 향상을 목격 했다 마우스12,,1314, 효 모9,,1516, zebrafish17, 초파리 melanogaster18,19 , 꼬마 선 충16, 애기 thaliana20,,2122, 그리고 인간의 기생충23,24,25 . 이러한 진보 카스텔로 연구진이 개발한 RBP 캡처 전략에 의해 촉진 되어 있다 7 , Baltz 외. 8 2012 년에 RNA와 단백질 상호 작용, 많은 RNAs의 oligo(dT) 캡처 및 질량 분석 (MS)의 cross-linking vivo에서 UV-proteomic 프로 파일링 기반. 그러나, 그 많은 계정에 대 한 3%-5%만 진 핵 transcriptome26의 성숙한 mRNAs에 주로 존재 하는 사실을 감안할 때이 널리 사용 되는 전략은 RBPs non-poly(A) RNAs, 대부분 ncRNAs를 포함 한 상호 작용을 캡처할 수 그리고 사전 mRNAs입니다.

여기, 우리는 많은 non-poly(A) RBPs27transcriptome 전체 캡처에 대 한 최근 개발 된 전략의 세부 절차를 보고합니다. CARIC 되 나,이 전략 결합 vivo에서 UV cross-linking 및 photoactivatable 및 “클릭” nucleoside 유사 체 (는 클릭 반응에 참여할 수는 bioorthogonal 기능 그룹 포함)와 RNAs의 대사 라벨 4- thiouridine (4SU), 그리고 5-ethynyluridine (유럽 연합). CARIC 전략 이상적인 결과 얻기 위해 중요 단계는 효율적인 대사 라벨, UV cross-linking 및 클릭 반응, 그리고 RNA 무결성의 유지 관리 합니다. 클릭 반응에서 촉매로 사용 하는 Cu(I)는 RNAs의 조각화를 발생할 수 있습니다, 때문에 RNA 조각화를 줄일 수 있는 Cu(I) ligand 필수적 이다. 우리는 심각한 RNA 저하를 유발 하지 않고 세포 lysates의 효율적인 클릭 반응을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

RBP 캡처만 HeLa 세포에서 식별이이 프로토콜에서 설명 하는 있지만 다양 한 세포 유형으로, 그리고 아마도 생물 CARIC 전략을 적용할 수 있습니다. RBP 캡처, 게다가이 프로토콜 또한 MS 샘플 준비, 단백질 식별 및 정량화, proteomic 실험에 익숙하지 않는 사람들을 위해 도움이 될 수 있는 효율적인된 단계별 절차를 제공 합니다.

Protocol

주의: 해당 되는 경우, 사용 시 약 되어야 RNase 무료의 형태로 구입 하거나 RNase-무료, 용 매에 용 해 (diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 대부분의 경우-처리 물). 때 RNA 샘플 및 RNase 무료 시 약 처리, 항상 장갑 및 마스크를 착용 하 고 자주 RNase 오염을 피하기 위하여 그들을 변경. 1. 준비의 Lysate의 Metabolically 표시 및 UV 복사해올된 셀 EU와 4SU의 변화 관 문화 HeL…

Representative Results

품질 관리 단계의 대표적인 결과 표시 됩니다. 결과 단계 2.3.2 (그림 1)에서 설명 하는 젤에 형광 분석, 단계 4.1.3 (그림 2A)에서 설명 하는 서쪽 오 점 분석 및 단계 4.2.2 (그림 2B)에 설명 된 실버 얼룩 분석 수치 포함. 품질 관리 단계는 CARIC 프로토콜의 최적화를 위해 중요 합니다. 항상 대규모 RBP 식별 실험의 …

Discussion

공정한 RNA 무결성의 유지 관리는 성공적인 CARIC 실험 키 중 하나입니다. Cu(I) 및 주의 적절 한 ligands와 RNA 저하 줄일 수 있습니다 상당히, 비록 부분 저하 관찰 했다. EU와 실험 샘플에서 4SU의 대체 비율은 1.18%와 0.46%, 각각 (데이터 표시 되지 않음). 2000의 길이 그대로 RNAs에 대 한 nt, RNAs의 ~ 90% 이상의 EU 및 한 4SU 포함. 부분적으로 저하 RNAs의 길이 대 한 nt, RNAs의 ~ 70% 포함 하나 이상 EU와 한 4SU. 따라서, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 보조금 91753206, 21425204, 21521003 그리고 국가 주요 연구 및 개발 프로젝트 2016YFA0501500에 의해 지원 됩니다.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1
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References

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Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).
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